研究证实：大蝎子草可有效缓解大鼠骨关节炎症状

研究证实：大蝎子草可有效缓解大鼠骨关节炎症状

骨关节炎（osteoarthritis, OA）是一种常见的关节退行性疾病，主要表现为关节软骨的退化和破坏，导致疼痛、肿胀和功能障碍。目前，临床上尚无根治方法，主要通过药物治疗、物理治疗和手术治疗等手段缓解症状。近年来，中药在骨关节炎治疗中的应用受到越来越多的关注。本研究以苗药大蝎子草为研究对象，探讨其标准汤剂对大鼠骨关节炎的作用及机制。

1. 引言

大蝎子草为荨麻科蝎子草属植物，其味苦、辛，性凉，有毒，具有祛风解表、利气消痰、清热解毒等功效。现代研究发现，大蝎子草含有多种活性成分，如东莨菪内酯、对羟基肉桂酸、黄酮、三萜、多糖等，具有抗炎镇痛作用，常用于治疗风湿性关节炎、骨关节炎等。

标准汤剂是一种中药制剂，以中医理论和临床应用为前提，采用现代提取方法和标准化工艺，具有规范性和统一性。本研究以SD大鼠为实验对象，建立由木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸混合溶液诱导的骨关节炎模型，探讨大蝎子草标准汤剂对大鼠骨关节炎的药理作用及机制。

2. 材料与方法

2.1 实验主要试药

• 塞来昔布胶囊（批号DR7993，辉瑞制药有限公司）
• 木瓜蛋白酶（批号716M022，索莱宝科技有限公司）
• L-半胱氨酸（批号820N0219，索莱宝科技有限公司）
• 苏木素-伊红染液（货号C200301，C200403，珠海贝索生物技术有限公司）
• 大鼠肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β ELISA测定试剂盒（欣博盛生物科技有限公司）
• 50×TAE（北京索莱宝科技有限公司）
• 超纯PNA提取试剂盒（Ultrapure RNA Kit）（康为世纪公司）
• 绿色荧光核酸染料（10,000×）（北京索莱宝科技有限公司）
• HiScript II One Step qRT-PCR SYBR Green Kit（Vazyme公司）

大蝎子草药材由国药集团同济堂（贵州）制药有限公司提供，经贵州中医药大学魏升华教授鉴定。

2.2 实验动物

SPF级雄性SD大鼠60只，体质量180~220 g，购自长沙市天勤生物技术有限公司。

2.3 实验主要仪器

• RE-2000B型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）
• 转轮式切片机（徕卡-2016，德国）
• 正置荧光显微镜（DM500，德国徕卡）
• 成像系统（德国徕卡）
• 涡旋混合器（XW-80A，江苏其林贝尔）
• 自动酶标仪（EL10A，BIOBASE）
• 实时荧光定量（qRT-PCR）仪（QuantStudio 1, Applied Biosystems）
• 低温离心机（C2500，湖南湘仪实验仪器厂）
• 凝胶成像仪（4600SF，上海天能科技有限公司）
• 电子天平（PPT-A + 100，美国康州HZ电子科技有限公司）

2.4 方法

2.4.1 试剂的制备

• 大蝎子草标准汤剂制备：参照《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，采用水煎煮法，以纯水为提取溶剂，提前浸泡0.5 h。一煎料液比为1:16，武火煮沸后文火煎煮40 min；二煎料液比为1:14，武火煮沸后文火煎煮30 min。合并两次滤液，减压浓缩至0.98~1.10 g/mL。

• 阳性样品制备：纯水溶解塞来昔布胶囊。

• 造模试剂制备：以生理盐水为溶剂，溶解0.6 g木瓜蛋白酶和54 mg L-半胱氨酸，定容至10 mL。

2.4.2 造模、分组及给药

采用膝关节腔注射6%木瓜蛋白酶和0.09 mol/L L-半胱氨酸混合溶液的方法建立OA大鼠模型。将大鼠随机分为6组，每组10只：

• 空白组：注射等剂量生理盐水
• 模型组：注射造模溶液
• 阳性组：每天灌胃18 mg/kg剂量的塞来昔布胶囊溶液
• 大蝎子草标准汤剂低、中、高剂量组：每天分别灌胃1.25、2.5、5.0 g生药/kg的标准汤剂

给药持续4周。

2.4.3 样品收集与处理

给药结束后禁食24 h，麻醉后腹主动脉取血致死。收集胸腺和脾脏计算脏器指数。部分膝关节用4%多聚甲醛固定，另一部分剥离滑膜组织冻存。

2.4.4 指标检测

• 一般情况观察：记录体重变化、毛发、精神状态等。
• 脏器指数：计算胸腺和脾脏指数。
• HE染色：观察膝关节组织形态变化。
• ELISA法：检测滑膜组织中TNF-α、IL-1β水平。
• qRT-PCR法：检测软骨组织中Sox-9、MMP13、Colx mRNA表达水平。

2.5 统计学处理

采用SPSS 26.0软件分析处理数据。计量资料以（X¯±S）表示，ANOVA法分析、LSD检验方差齐性的数据；Welch法分析、Tamhanes法检验方差不齐的数据。P< 0.05表示差异具有统计学意义。

3. 结果

3.1 一般情况观察

造模后，模型组大鼠皮毛暗淡，精神状态较差，进食减少，体重减轻或增长缓慢，行动力差，活动量较少，膝关节红肿较严重。经给药干预后，各给药组大鼠精神状态逐渐好转，皮毛变顺滑，饮食逐步增加，活动量增加，膝关节红肿程度减轻。其中，大蝎子草标准汤剂低剂量组体重增长最显著。

3.2 免疫器官脏器指数

与空白组相比，模型组胸腺指数、脾脏指数均高于空白组，但无显著性差异（P > 0.05）。与模型组相比，大蝎子草标准汤剂组的胸腺指数和脾脏指数均低于模型组，其中低剂量组和高剂量组胸腺指数显著降低（P < 0.05），低剂量组和中剂量组脾脏指数显著降低（P < 0.05）。

3.3 膝关节病理变化

空白组大鼠膝关节未见明显病理改变，表面软骨完整，平滑。模型组大鼠膝关节表面透明软骨出现纤维组织增生，炎性细胞浸润。各给药治疗组大鼠膝关节组织病变均有所改善，但仍存在透明软骨被破坏、纤维化、炎性细胞浸润等病理变化。

空白组(200×) 模型组(200×)纤维化(→)

阳性组(200×)纤维化(→) 大蝎子草标准汤剂低剂量组(200×)纤维化(→)

大蝎子草标准汤剂中剂量组(200×)纤维化(→)大蝎子草标准汤剂高剂量组(200×)纤维化(→)

图1. 各组大鼠膝关节组织的病变情况(HE, ×200)

3.4 滑膜组织中炎症因子水平

与空白组相比，模型组大鼠滑膜组织中TNF-α和IL-1β水平均极显著升高（P< 0.01）。与模型组相比，各给药治疗组大鼠滑膜组织中两种炎症因子水平（除大蝎子草标准汤剂中剂量TNF-α水平外）均极显著降低（P< 0.01），且大蝎子草标准汤剂不同剂量组大鼠膝关节滑膜组织中IL-1β水平呈剂量依赖性增加。

3.5 软骨组织基因表达

与空白组比较，模型组Sox-9 mRNA表达量极显著降低（P< 0.01），MMP13、Colx mRNA表达量极显著增加（P< 0.01）。与模型组相比，除大蝎子草标准汤剂低剂量组外，中剂量组和高剂量组Sox-9 mRNA的表达均显著高于模型组（P< 0.05）；各给药治疗组中MMP13、Colx mRNA表达量均极显著性低于模型组（P< 0.01）。

4. 讨论

骨关节炎是关节退行性疾病，主要表现为关节软骨的退化和破坏，导致疼痛、肿胀和功能障碍。TNF-α和IL-1β是OA炎症反应中的主要促炎因子，能够诱导多种趋化因子、其他炎症因子的产生，影响软骨细胞的合成、代谢。MMPs是一类重要的酶，参与机体多项生物学过程，与骨关节炎相关的MMP-13和MMP-3等对软骨基质降解有直接作用。Sox-9是软骨形成过程中的关键性转录因子，可调节软骨细胞外基质基因的表达。Colx基因在OA患者软骨下层区域高度表达，多于肥大软骨细胞或钙化处特异性表达。

研究发现中药有效成分防治骨关节炎的作用机制主要包括减少炎症因子、降低氧化应激反应的发生、抑制基质降解酶活性、调控软骨细胞代谢及调控相关信号通路等方面。大蝎子草含有对羟基肉桂酸、总黄酮、芹菜素、山萘酚、多糖等多种有效成分，其中总黄酮、山萘酚和多糖具有抗炎镇痛作用，芹菜素具有调节骨质疏松、调节骨细胞的作用。本研究实验结果表明，大蝎子草标准汤剂对大鼠骨关节炎具有一定治疗作用，能够改善相关症状，降低炎症因子水平，并影响特定基因的表达。其作用机制可能与增高软骨组织中Sox-9的mRNA的表达量和降低MMP13、Colx的mRNA的表达量有关，但具体哪些成分具有关键作用值得进一步研究。