浙大团队创新微生物诱变技术，柔红霉素产量增三倍
浙大团队创新微生物诱变技术，柔红霉素产量增三倍
本发明属于微生物诱变领域，具体涉及一种高产柔红霉素的链霉菌及其制备方法与应用。
背景技术
柔红霉素是由波赛链霉菌(streptomyces peucetius)或天蓝淡红链霉菌(streptomyces coeryleorubidus)等菌株经次级代谢产生的一种蒽环类抗生素。它具有抗革兰氏阴性菌、抗革兰氏阳性菌、抗肿瘤及抗病毒的作用，并有免疫抑制活性(nature1964,201:706)。临床上主要用于急性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、骨髓性白血病等。柔红霉素已广泛应用于肿瘤化疗，有巨大的经济价值和社会效益。但是由于柔红霉素是具有细胞毒性的抗肿瘤抗生素，其原始菌株的发酵水平很低，工业上生产成本较高。
目前国内外提高柔红霉素产量的方法主要围绕菌种选育，基因突变株筛选和优化发酵培养基等。其中，菌种选育是发酵工业的重要环节。遗传和变异是菌种选育的遗传学基础。自然界中微生物有益的自发突变的速度远低于菌种选育的工业需求，这就迫切要求我们能加快菌种的突变频率，在尽可能短的时间内获得适合工业需要的微生物菌种。诱变育种应运而生。物理诱变如紫外线、激光、x射线、γ射线等可以在短时间内获得大量优质的突变株，是常用的诱变育种方法。紫外诱变操作简单，但突变效率较低；其它几种射线诱变有一定的辐射残留，危害健康。因此，寻找利用一种更安全简便，激活效率更高的方法来诱变菌株以提高柔红霉素的产量，大幅度减少成本，具有重要的市场应用价值。此外，菌株诱变后会产生大量的突变株，如何从成百上千的突变株中快速筛选出高产克隆也具有挑战。
技术实现思路
针对现有技术中对于诱变得到高产柔红霉素菌株以及在诸多突变株中快速筛选得到高产克隆的需求，本发明提供了一种高产柔红霉素的链霉菌及其制备方法与应用，具体技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种高产柔红霉素的链霉菌，分类命名为streptomycescoeruleorubidus 14-4f，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2024年2月1日，保藏编号为cgmcc no.29839。
第二方面，本发明提供了上述高产柔红霉素的链霉菌的制备方法，包括以下步骤：s1：将(streptomyces coeruleorubidus)11043种子液均匀涂布于isp4琼脂板上，培养得到孢子悬浮液；
s2：将孢子悬浮液进行高能电子束辐照诱变；
s3：对进行诱变后的孢子悬浮液进行培养，筛选得到高产柔红霉素的链霉菌(streptomyces coeruleorubidus)14-4f。
进一步地，s2中，所述高能电子束辐照诱变的能量为9～10mev，吸收剂量为3～4kgy/s；诱变剂量为5～7kgy。
进一步地，s2中，所述高能电子束辐照诱变的电子束能量为10mev，电流为1.5ma，扫描频率为335hz，吸收剂量为4kgy/s，诱变剂量为6kgy。
进一步地，s3中，所述培养的方法为：将混匀后的菌悬液作梯度稀释，分别取不同稀释倍数的菌液涂布于isp4琼脂板上培养6～8天；之后将培养的菌株接种于yeme液体中培养1～2天，吸取菌液接种于r4培养基中发酵5天。
进一步地，s3中，所述筛选的方法为：将培养得到的发酵液进行离心，对上清液进行离子色谱-质谱联用检测，通过质谱检测确认产物为柔红霉素，通过离子色谱检测得到的离子色谱图的峰面积确认柔红霉素产量提升最高，得到链霉菌(streptomycescoeruleorubidus)14-4f。
第三方面，本发明提供了上述链霉菌在生产柔红霉素中的应用。
第四方面，本发明提供了一种高通量筛选柔红霉素高产菌株的方法，包括以下步骤：
s1：将可生产柔红霉素的出发菌株的发酵液的离心上清液以及柔红霉素标准品进行液相色谱检测以及离子色谱-质谱联用检测，确认发酵液中柔红霉素的吸收峰；
s2：将出发菌株进行诱变育种，并进行高通量培养发酵；
s3：将s2进行高通量培养发酵的发酵液的离心上清液进行离子色谱-质谱联用检测，通过质谱检测以确认产物为柔红霉素，通过离子色谱检测得到的离子色谱图的峰面积进行柔红霉素产量的筛选，得到高产柔红霉素的链霉菌。
进一步地，所述出发菌株为天蓝淡红链霉菌(streptomyces coeruleorubidus)11043，菌株编号为cicc 11043，保藏单位为中国工业微生物菌种保藏管理中心。
进一步地，所述高能电子束诱变的参数为：高能电子束能量为10mev，吸收剂量为4kgy/s；诱变剂量为6kgy。
进一步地，进行筛选之后得到的高产柔红霉素的链霉菌分类命名为streptomycescoeruleorubidus 14-4f，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2024年2月1日，保藏编号为cgmcc no.29839。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过高能电子束诱变得到了一株柔红霉素高产的突变株，其柔红霉素的产量最高可以达到出发菌株的3倍左右。
(2)本发明中，通过高能电子束诱变结合高分辨质谱筛选，建立了一种柔红霉素高产突变菌株的高通量筛选方法。
技术特征
一种高产柔红霉素的链霉菌，其特征在于：分类命名为streptomycescoeruleorubidus14-4f，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2024年2月1日，保藏编号为cgmcc no.29839。
如权利要求1所述的高产柔红霉素的链霉菌的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
根据权利要求2所述的高产柔红霉素的链霉菌的制备方法，其特征在于：s2中，所述高能电子束辐照诱变的能量为9～10mev，吸收剂量为3～4kgy/s，诱变剂量为5～7kgy。
根据权利要求2所述的高产柔红霉素的链霉菌的制备方法，其特征在于：s3中，所述培养的方法为：将混匀后的菌悬液作梯度稀释，分别取不同稀释倍数的菌液涂布于isp4琼脂板上培养6～8天；之后将培养的菌株接种于yeme液体中培养1～2天，吸取菌液接种于r4培养基中发酵5天。
根据权利要求2所述的高产柔红霉素的链霉菌的制备方法，其特征在于：s3中，所述筛选的方法为：将培养得到的发酵液进行离心，对上清液进行离子色谱-质谱联用检测，通过质谱检测确认产物为柔红霉素，通过离子色谱检测得到的离子色谱图的峰面积确认柔红霉素产量提升最高，得到链霉菌(streptomyces coeruleorubidus)14-4f。
如权利要求1所述的链霉菌，或如权利要求2～5中任一项所述的制备方法制备得到的链霉菌在生产柔红霉素中的应用。
一种高通量筛选如权利要求1所述的柔红霉素高产菌株的方法，其特征在于：包括以下步骤：
根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述出发菌株为链霉菌(streptomycescoeruleorubidus)11043，菌株编号为cicc 11043，保藏单位为中国工业微生物菌种保藏管理中心。
根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述高能电子束诱变的参数为：高能电子束能量为10mev，吸收剂量为4kgy/s；诱变剂量为6kgy。
根据权利要求8所述的方法，其特征在于：s3中，进行筛选之后得到的高产柔红霉素的链霉菌分类命名为streptomyces coeruleorubidus 14-4f，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2024年2月1日，保藏编号为cgmcc no.29839。
技术总结
本发明属于微生物诱变领域，具体涉及一种高产柔红霉素的链霉菌及其制备方法与应用，本发明通过高能电子束诱变、结合高分辨质谱高通量筛选得到一种高产柔红霉素的链霉菌，分类命名为Streptomyces coeruleorubidus 14-4F，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2024年2月1日，保藏编号为CGMCC No.29839。本发明得到的突变菌株柔红霉素的产量最高可以达到出发菌株的3倍，并且在本发明中，通过高能电子束诱变结合高分辨质谱筛选，建立了一种柔红霉素高产突变菌株的高通量筛选方法。
技术研发信息
技术研发人：徐飞,冯新媛,张艺菲
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：
技术公布日：2024/8/27