精准调控糖基化，提升抗体药物疗效

精准调控糖基化，提升抗体药物疗效

糖基化是抗体药物生产中至关重要的一步，它不仅影响药物的稳定性，还关系到药物的疗效和安全性。通过对糖基化过程的精细调控，可以显著改善抗体药物的效果。本文将详细介绍如何通过优化糖基化来提升抗体药物的表现，从而实现更好的治疗效果。

抗体药物的活性除了由氨基酸序列决定外，翻译后修饰亦对活性有重大影响，在众多的蛋白质翻译后修饰（PTM）中，糖基化修饰是最重要和最复杂的修饰之一，占到所有PTM的50%以上，其糖基化位点、糖型种类及丰度都可能影响产品的有效性、安全性和质量稳定性，因此糖基化被普遍认为是抗体的关键质量属性（CQA）之一。糖基化修饰受细胞系、培养条件、纯化工艺等多因素的影响，目前已有多种糖基化分析技术，对糖基化过程和影响都有了更深的理解，也有助于更好地控制糖基化修饰的过程。

主要的糖基化有N-糖基化和O-糖基化。N-糖基化是最普遍、研究最多的糖基化修饰。IgG的N-糖基化位于Fc片段的CH2区的共有序列（Asn-X-Ser/Thr，X可以是除Pro的任意氨基酸残基），寡糖中的GlcNAc与Asn残基上的酰胺氮连接形成N-糖基化，起始于内质网完成于高尔基体。O-糖基化是由寡糖中的GalNAc与Ser/Thr残基上的羟基连接形成，在高尔基体完成。

糖基化对蛋白性质的影响主要体现在以下几个方面：

1. 质量稳定性：糖基化可增加蛋白对热、变性剂及蛋白酶的抵抗力，进而维持蛋白结构完整性。另外，糖基化修饰还能提高蛋白的溶解度，如糖链唾液酸因其含有亲水的基团而在一定程度上屏蔽了疏水作用从而提高了蛋白的溶解性。
2. 安全性和有效性：人体细胞专一性地合成Neu5Ac唾液酸，而其它哺乳动物细胞不仅合成Neu5Ac唾液酸，还可合成对人类具有免疫原性的Neu5Gc唾液酸。NS0和SP2/0细胞通常会高表达唾液酸，并且其中Neu5Gc唾液酸的比例最高可达到3%。因此生产抗体时，如果Neu5Gc唾液酸不能安全去除则可能存在引起人体免疫反应的风险。人类细胞单一地表达β-1,4-半乳糖，而其他哺乳动物细胞还表达对人类具有免疫原性的α-1,3-半乳糖。NS0和SP2/0细胞生产的抗体中可能会有这种半乳糖修饰，这类抗体在使用时应严加控制，将其免疫原性降低在可接受范围内。唾液酸化可以延长血清中糖蛋白的存在时间。当糖蛋白去唾液酸化后，其可被去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)识别，从而导致半衰期的大幅减少。高甘露糖型会显著降低血清中抗体的半衰期。
3. 生物活性：单克隆抗体通过其Fc部位结合各种FcγRs,进而发挥其效应功能，主要包括ADCC 、ADCP和CDC功能。Fc还能够以pH依赖的方式结合新生的Fc受体（FcRn），避免被核内体降解，从而延长单克隆抗体的半衰期。唾液酸化会影响抗体与FcγRIIa的结合，从而降低抗体ADCC活性；岩藻糖是影响ADCC活性最重要的单糖，去岩藻糖化可以显著提高抗体与FcγRIIIa的亲和力及ADCC活性(最高达100倍)。半乳糖化可以增加抗体与补体的结合，从而增加抗体的CDC活性。此外，提高半乳糖化可以提高抗体的ADCC活性，但与岩藻糖化相比只是辅助功能。重链上高水平无糖基化修饰的抗体(NGHC)中还没有发现其具有免疫原性，同样也不具有生物活性。NGHC型抗体完全失去了FcγRIII的结合能力，与C1q的结合能力也降低了10倍，从而导致该类型抗体失去了ADCC和CDC活性。此外，半糖基化单抗(一条糖链) 与完全糖基化(两条糖链)单抗相比，ADCC和CDC活性均有所下降。

目前，多家公司已经开发出先进的糖基化优化技术平台，这些技术平台通过定点偶联技术，实现了抗体药物的精准修饰，显著提升了药物的效果。

1. Synaffix的GlycoConnect技术
   作为N-糖基化偶联技术的先锋，Synaffix的GlycoConnect技术可概况为两酶三步法。首先优化筛选出能够具有优异催化效能的内切糖苷酶Endo-SH，该酶对于抗体N297杂合型、高甘露糖型及复合型糖均有很好的催化效率，抗体糖链经过酶的改造，释放其Core GlcNAc；其次通过筛选得到的野生型糖基转移酶TnGalNAc-T，将带有叠氮基团的linker同第一步释放的抗体Core GlcNAc偶联，最后通过叠氮基团同DBCO的Click反应，实现payload同抗体的定点偶联。同时文献报道，在温和的反应条件下，可以将抗体、Endo-SH酶、带有叠氮基团的linker和TnGalNAc-T同时放入同一个反应体系中，实现两酶两步法。

2. 糖岭生物的DisacLink技术
   DisacLink技术为糖岭生物开发的第二代糖基化偶联技术（第一代为OligosacLink），通过筛选得到的野生型糖苷内切酶Endo-S2，同时兼具水解抗体糖链及转移糖链功能的双功能酶，通过对糖链结构的筛选得到转移效率最佳的二糖底物LacNac-Oxa(2C)，同时研究发现在LacNac-Oxa的6号位进行改造并不影响Endo-S2的活性，因此对此位置引入叠氮基团或毒素分子，可以实现一酶两步偶联或一酶一步偶联，极大简化糖基化偶联的工艺步骤，并缩短反应时间，同时因为反应过程不会引入有机溶剂，工艺可开发性强，后续放大生产性强。

3. 康宁杰瑞的糖定点偶联技术
   康宁杰瑞的糖定点偶联技术平台如下图所示，整体概括为单酶两步法，核心步骤为Step1，即在β-1,4-半乳糖基转移酶的催化作用下，UDP-GalNAz被转移至抗体的末端已酰葡萄糖胺上，从而引入叠氮基团，进而为第二步payload通过点击化学的方法偶联至抗体上。但对于抗体糖链末端的结构如何做到统一（抗体制备过程控制策略），是否需额外修饰，并无太多信息披露。

4. 岩唐生物的YTConju技术
   岩唐生物YTConju™-岩藻糖基化定点偶联技术平台通过对抗体Fc区域保守的糖基化位点进行酶化学法改造，并利用高效的岩藻糖基转移酶和改构后的岩藻糖衍生物实现了“一步法”偶联。利用不同的酶组合方案，在使用同一种岩藻糖衍生物的情况下，该技术平台可分别实现DAR4 （G2F）构型和DAR2（A-LacNAc）构型的抗体偶联物的构建，且获得的抗体偶联物均具有高度均一、亲水以及稳定的特性，并有着出色的体内外药效。

糖基化优化技术已经在多个ADC药物的开发中得到应用，并取得了显著的疗效。

1. Synaffix的GlycoConnect技术已与超过10家企业展开合作，包括ADC Therapeutics、Mersana Therapeutics和美雅珂，信达等多家药企。通过采用Synaffix平台技术，信达生物的IBI343是全球首款进入三期临床阶段的Claudin18.2 ADC新药，美雅珂的MRG004A 是国内首批获批临床的TF-ADC药物，目前正在中国及美国同时进行临床I/II期研究，并已在胰腺癌、三阴乳腺癌及宫颈癌等适应症中观察到抗肿瘤活性信号。

2. 康宁杰瑞利用其特有的糖定点偶联平台自主研发了新型靶向HER2双表位的抗体偶联药物（ADC）JSKN003（临床III期）和JSKN-016（临床前）。JSKN003是康宁杰瑞基于HER2双抗KN026（anbenitamab）开发的一款ADC药物，目前是全球唯一一款进入III期阶段的HER2双抗ADC。

随着生物制药技术的不断发展，糖基化优化技术将在抗体药物的开发中发挥越来越重要的作用。未来，糖基化优化技术的发展趋势将主要集中在以下几个方面：

1. 糖基化修饰的精准控制：通过更精确的糖基化修饰技术，实现对糖链结构的精细调控，进一步提升抗体药物的疗效和安全性。

2. 新型糖基化修饰技术的开发：随着对糖基化修饰机制的深入理解，新的糖基化修饰技术将不断涌现，为抗体药物的开发提供更多的选择。

3. 糖基化修饰与抗体工程的结合：通过将糖基化修饰与抗体工程相结合，开发出具有更好疗效和安全性的新型抗体药物。

4. 糖基化修饰的个性化应用：随着精准医疗的发展，糖基化修饰技术将更多地应用于个性化治疗，为患者提供更精准的治疗方案。

总之，糖基化优化技术在抗体药物开发中的应用前景广阔，通过不断的技术创新和优化，将为患者带来更好的治疗效果。