一种快速检测细菌抗生素敏感性的方法与流程

一种快速检测细菌抗生素敏感性的方法与流程

近年来，随着抗生素的滥用，细菌耐药性问题日益严重，快速准确地检测细菌对抗生素的敏感性成为临床治疗的关键。本文介绍了一种创新的快速检测方法，通过结合荧光染色技术和葡萄糖辅助孵育，能够在1小时内完成检测，为临床治疗提供及时可靠的参考。

背景技术

1. 细菌耐药问题是全球性的问题，抗生素的滥用使得耐药细菌不断增加，甚至出现了耐多种抗生素的超级细菌。在临床上，对耐药菌进行快速鉴别是必要的。

2. 目前主流医院机构采用的传统表型药敏实验（如纸片扩散法和微量肉汤稀释法）耗时较长，对常见生长快的细菌需要1天，而生长慢的细菌则需几周时间。分子药敏检测技术（如质谱、NGS）虽有优势但应用受限，自动药敏检测仪（如梅里埃VITEK-2）虽简便但结果仍需十几个小时。

3. 现有自动化药敏测定仪多采用光电比色法和荧光法，但存在假阴性问题；华大基因的分子生物学方法成本高且普适性低；生化法试剂盒适用范围小；拉曼光谱法和形态变化检测法虽能缩短时间但通量低、准确性待验证。

技术实现思路

为了解决现有检测方法耗时长的问题，本发明提供了一种快速检测细菌抗生素敏感性的方法。该方法通过以下步骤实现：

1. 混合液制备：将待测菌株菌液、抗生素和葡萄糖制成混合液，进行孵育，得到混合试剂。

2. 染色处理：将不同荧光颜色的活菌染色剂（如SYBR Green I）和死菌染色剂（如碘化丙啶）加入到混合试剂中，进行染色。

3. 荧光检测与判断：分别检测活菌染色剂和死菌染色剂对应的荧光强度，通过特定公式计算细菌存活率，据此判断细菌的抗生素敏感性。

该方法的核心创新在于：

• 无需细菌生长：通过荧光染色直接检测活菌和死菌比例，避免了传统方法中需要等待细菌生长的过程。

• 葡萄糖辅助孵育：添加葡萄糖可以提高检测准确性，使耐药株与敏感株区分更明显。

• 快速检测：整个检测过程可在1小时内完成，大大缩短了检测时间。

• 操作简便：实验全程操作量少，减少了人为操作误差的影响。

具体实施步骤

1. 混合液制备：将葡萄糖溶于水中制成溶液，与抗生素溶液和待测菌株菌液混合。其中，葡萄糖浓度不低于10mM，抗生素浓度为50～1600μg/ml，孵育温度为35～37℃，时间为0.5～1h。

2. 染色处理：将活菌染色剂和死菌染色剂与水混合制成染色剂溶液，然后与混合试剂混合。染色温度为35～37℃，时间为20～30min。

3. 荧光检测与计算：

• 在预设时间点检测荧光强度，计算v值或g/r值。
• 通过标准曲线计算出存活率s1和s2，根据相对活率rs判断细菌敏感性。

适用范围与优势

• 适用菌种：适用于肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌等多种临床常见菌种。

• 优势：

• 快速：1小时内完成检测。

• 准确：通过葡萄糖辅助孵育提高准确性。

• 简便：操作步骤简单，减少人为误差。

• 实用：适用于多种临床常见菌种和抗生素类型。

该方法为临床快速准确地判断细菌对抗生素的敏感性提供了新的解决方案，有助于优化抗生素使用策略，减少耐药性的发展，为患者提供更精准的治疗方案。