PCR反应中引物的作用及引物设计原则

PCR反应中引物的作用及引物设计原则

PCR（聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，可用于扩增DNA序列。在PCR反应中，引物是起关键作用的短链DNA分子，它们会与待扩增DNA序列的两端匹配，指示聚合酶在这些位置开始复制DNA。

引物在PCR反应中的作用

引物在PCR反应中的作用可以归纳为以下几个方面：

1. 定义PCR扩增的目标序列：PCR扩增需要在待扩增DNA序列的两端放置引物，引物的选择和设计可以确保PCR扩增特定的DNA序列。引物的序列应该能够与待扩增DNA序列的两端互补匹配，以便在PCR反应中进行扩增。

2. 促进DNA序列的复制：一旦引物与待扩增DNA序列的两端匹配，聚合酶就会沿着DNA模板链复制新的DNA链。引物的序列决定了聚合酶的起始位置和方向。

3. 控制PCR反应的特异性：引物的选择和设计可以控制PCR反应的特异性，以避免非特异性扩增产物的形成。引物的长度、GC含量、Tm值等特性会影响引物的特异性。

4. 影响PCR反应的效率：引物浓度、长度、Tm值等因素也会影响PCR反应的效率和产量。正确的引物浓度和设计可以确保PCR反应的高效率和特异性。

引物设计的基本原则

通常来说，引物的设计需要遵守一些基本的原则。这些原则很细，很多，也很繁琐。但实际上对于常规的引物，并不需要考虑太多，达到实验目的即可，更多的情况下需要灵活选择。

一般来说，引物设计需要遵循以下原则：

1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。
3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。
5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)。
6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。
7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。

但是在实际设计过程中，往往很难同时满足以上条件，因此只需要在设计引物时尽可能满足即可，没必要太过纠结。

同时需要注意，各种模板的引物设计难度不一，具体情况需要具体看待。有的模板本身GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的PCR因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。