Trizol法提取RNA：从样本前处理到操作步骤

Trizol法提取RNA：从样本前处理到操作步骤

Trizol法是实验室中常用的RNA提取方法，广泛应用于各种生物样本的RNA提取。本文详细介绍了Trizol法提取RNA的实验原理、样本处理方法和具体操作步骤，对于从事相关实验研究的科研人员具有较高的参考价值。

实验原理

Trizol试剂的主要成分是苯酚，对细胞进行裂解，使细胞中的蛋白质以及核酸物质解聚。苯酚虽然可以有效的使蛋白质变性，但它不能完全抑制RNA酶的活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（即RNA酶）。存放在Trizol 中的样品可以在负八十保存半年左右。

样本处理方法

贴壁培养细胞

1. 吸出培养液，细胞用预冷的1×PBS清洗两次。
2. 吸出PBS洗液，然后每1×108-2×107的培养细胞中加入1 ml的Trizol，轻摇培养皿，确保溶液均匀分布于细胞表面。（可用细胞刮刀剥离细胞）
3. 使用移液器反复吹打使细胞脱落，然后将内含细胞的裂解液转移至离心管中，再用移液器吹打直至裂解液中无明显沉淀（溶液清亮）。
4. 室温静置5-10分钟后，再进行后续的RNA提取操作。

悬浮培养细胞

1. 将悬浮细胞收集至离心管中，12000 rpm 4℃离心2分钟，弃上清，用预冷的1×PBS清洗两次。
2. 向1×106-2×107细胞中加入1ml的Trizol。
3. 用移液器吹打至裂解液清亮无明显沉淀。
4. 室温静置5-10分钟后，再进行后续的RNA提取操作。

动物组织、植物材料样品

1. 将准确称取的RNA提取样品转移液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织（研磨过程中需要不断向研钵中补加液氮），直至研磨成粉末状，然后向粉末中加入适量的Trizol并混匀。（针对柔软易裂解的组织样本，可以使用匀浆器加入适量Trizol进行匀浆裂解。）
2. 将上述混合液转移至离心管中，用移液器反复吹打充分混匀。室温静置5分钟，12,000 rpm 4℃离心5-10分钟。
3. 小心吸取上清液，移入新的离心管中，再进行后续的RNA提取操作。

操作步骤

1. 样本前处理。
2. 向上述裂解液中加入Trizol体积量1/5氯仿，充分混合（涡旋或用枪头混匀）。室温静置15分钟。
3. 12000 rpm 4℃离心15分钟。小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：上清液（含RNA）、中间蛋白层及下层有机相。吸取上清液转移至另新的离心管中。
   注：每管大概取 200-300 μl，此步骤非常关键，提出的RNA质量好纯度高即可。若吸取水相时吸到有机相会导致双峰，A260/230特别低。
4. 沉淀 RNA：向其中加入相同体积异丙醇，上下颠倒混匀。在-20℃放置10 min。12000 rpm 4℃离心10 min后弃去上清。
5. 清洗 RNA：向沉淀中加入500 μl 预冷的无水乙醇，吹散沉淀洗涤RNA，洗涤两次，12000 rpm 4℃离心后弃去上清。
   注：把沉淀弹起来，让其悬浮在酒精中，然后放1-2min，让酒精充分接触沉淀，充分溶解有机试剂，然后再离心。
6. 打开离心管，室温干燥沉淀约5分钟。
   注：不要离心干燥，否则RNA将很难溶解，如果残留乙醇较多可延长干燥时间。
7. 向离心管中加入20 μl DPEC水溶解RNA。将溶解后的RNA放入-80℃保存。
   注：如果提取的是组织样本，溶解液可以多加点。
8. 取2 μl进行电泳。

注意事项

1. 防止RNA酶污染。

• 戴好口罩，手套。
• 全程最好在生物安全柜操作（根据实验条件）
• 实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保RNase-Free。耗材均需要通过DPEC处理。

2. 明确目标。

• 提取成功标准是RNA的质量和纯度，而不是得率。

3. 测量结果：

• A260/A280：1.8-2.2，若<1.8则表明有蛋白质污染；
• A260/A230：1.5-2.4，若<1.5则表明有明显的有机物如糖、肤、苯酚的污染。

参考资料：

• https://images.app.goo.gl/nA6CTBzDRZE4pSTw6
• https://images.app.goo.gl/XGPq7nQBPYGG2X7N6