Cut&Run与Cut&Tag：基因组蛋白-DNA相互作用研究技术详解

Cut&Run与Cut&Tag：基因组蛋白-DNA相互作用研究技术详解

引用

CSDN

1.

https://blog.csdn.net/Da_gan/article/details/144515894

Cut&Run（Cleavage Under Targets & Release Using Nuclease）和Cut&Tag（Cleavage Under Targets & Tagmentation）是两种用于研究基因组蛋白-DNA相互作用的技术。它们以高灵敏度和低背景噪声著称，成为表观遗传学研究中的重要工具。

Cut&Run技术

技术概述

Cut&Run是一种基于抗体的技术，用于研究转录因子、核小体及其他染色质相关蛋白与DNA的结合。它通过将蛋白结合的特定位点切割下来，释放与其相连的DNA片段，并随后测序来确定结合位点。

技术流程

1. 样本制备：

• 从细胞或组织中分离细胞核，或者直接使用固定的完整细胞。
• 使用玻片或磁珠固定细胞核，确保实验过程中样本稳定性。

2. 抗体结合：

• 添加针对目标蛋白的特异性抗体，与目标蛋白结合。
• 抗体通常能够精确定位靶蛋白。

3. 蛋白A/G融合核酸酶结合：

• 引入融合蛋白（如蛋白A或G与微球菌核酸酶的融合体），其能够通过抗体与目标蛋白结合。

4. 核酸酶活化与切割：

• 添加低浓度的Ca²⁺激活核酸酶，使其在靶点附近切割DNA。
• 仅切割与目标蛋白结合的DNA片段，减少非特异性背景。

5. 释放与回收DNA：

• 通过温和裂解或离心分离，将切割下来的DNA片段释放到上清中。
• 回收DNA用于下游测序。

6. 高通量测序与分析：

• 构建文库后，通过Illumina等平台进行高通量测序。
• 使用生物信息学工具识别蛋白结合位点。

技术特点

• 灵敏度高：由于背景噪声极低，Cut&Run技术能检测到稀有的蛋白-DNA相互作用。
• 操作简单：不需要大量的细胞，也无需复杂的核酸免疫沉淀步骤。
• 背景噪声低：由于反应在细胞核中原位完成，未结合的核酸酶被轻松洗脱。
• 需求样本量少：适用于小数量或珍贵样本。

应用

• 研究转录因子结合：精准定位转录因子在基因组中的结合位点。
• 分析表观修饰：研究组蛋白修饰标记，如H3K27me3、H3K4me3。
• 染色质结构研究：探索染色质结合蛋白的分布规律。
• 研究动态变化：监测细胞状态或外界刺激对蛋白-DNA结合的影响。

Cut&Tag技术

技术概述

Cut&Tag是Cut&Run的升级版本，用于检测DNA结合蛋白和表观遗传修饰。它结合了转座酶技术（Tn5），直接在目标DNA结合位点上进行文库制备，进一步简化了流程和提升了效率。

技术流程

1. 样本制备：

• 与Cut&Run类似，细胞固定后提取细胞核，或直接使用完整细胞。

2. 抗体结合：

• 加入针对目标蛋白的抗体，使其结合到目标蛋白。

3. 转座酶结合：

• 添加融合转座酶（Tn5）和蛋白A或G，形成复合体。
• 转座酶通过抗体被精准招募到目标蛋白附近。

4. 文库生成：

• 在目标位点，Tn5插入并标记DNA片段，同时添加测序接头。
• 这一步直接生成可用于测序的文库，省略了传统建库步骤。

5. 高通量测序与分析：

• 直接对生成的文库进行测序，识别目标蛋白的结合区域。

技术特点

• 极高灵敏度：能够从少量细胞或单细胞样本中捕获蛋白-DNA结合信息。
• 操作简化：通过整合转座酶，直接完成文库构建，大幅减少实验时间。
• 样本需求少：对稀有细胞群体或单细胞样本友好。
• 适配多种应用：兼容多种蛋白-DNA研究需求，包括组蛋白修饰、转录因子结合等。

应用

• 研究染色质开放性：通过分析组蛋白修饰标记（如H3K27ac）推断染色质活性。
• 转录因子研究：识别转录因子的结合位点及其调控网络。
• 单细胞分析：Cut&Tag能够在单细胞水平上解析染色质状态。
• 开发新的表观遗传标记：研究未知蛋白或新表观修饰的功能。

Cut&Run和Cut&Tag的对比

两者的局限性

1. 抗体质量依赖性：

• 两种技术都需要高质量、特异性强的抗体。抗体性能不足可能导致信号不佳或非特异性绑定。

2. 数据分析复杂性：

• 数据处理和分析需要高水平的生物信息学工具，特别是在处理大规模单细胞数据时。

3. 对细胞固定的敏感性：

• 固定步骤可能影响蛋白的天然结合状态，需优化实验条件。

未来发展方向

1. 与其他组学技术整合：

• 如结合RNA测序（RNA-Seq）或空间组学技术，实现多维表观遗传分析。

2. 单细胞水平优化：

• 提高灵敏度和分辨率，进一步降低对细胞数量的需求。

3. 新型标记方法：

• 开发更高效的转座酶或核酸酶，提高DNA标记效率。

4. 高通量自动化：

• 通过微流控和机器人技术实现高通量的表观遗传学研究。

Cut&Run和Cut&Tag以其高灵敏度、低背景和灵活性，推动了表观遗传学研究的发展，为解析基因调控网络和染色质状态提供了强有力的工具。