基于腺病毒的VLP：黑色素瘤免疫治疗的新希望
基于腺病毒的VLP：黑色素瘤免疫治疗的新希望
黑色素瘤是一种恶性程度极高的皮肤肿瘤，其发病率在近年来呈逐年上升的趋势。传统的治疗方法如手术、放疗和化疗虽然在一定程度上能够控制肿瘤的生长，但往往伴随着严重的副作用，且对于晚期患者的疗效并不理想。因此，寻找一种更加有效、安全的治疗方法迫在眉睫。免疫治疗的出现为黑色素瘤的治疗带来了新的思路。通过激活机体自身的免疫系统来识别和攻击肿瘤细胞，免疫治疗具有特异性强、副作用小等优点。
近年来，疫苗作为一种激发机体自身免疫系统对抗肿瘤的策略而备受关注。在众多的研究方向中，病毒样颗粒（Virus - Like Particles，VLPs）作为一种极具潜力的疫苗平台，正受到越来越多的关注。格勒诺布尔大学学者曾在Molecular Therapy Methods & Clinical Development发表了题目为《Stimulation of the immune system by a tumor antigen-bearing adenovirus-inspired VLP allows control of melanoma growth》的文章，他们以小鼠的黑色素瘤B16 -卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）模型为基础评估了两种疫苗平台（直接表位展示和通过链间二硫键进行的大抗原融合）在癌症免疫治疗中的潜力。今天，我们就来深入了解一下VLP在黑色素瘤治疗方面的研究进展，看看它是如何为癌症患者打开希望之门的。
一、VLPs简介
VLPs是一种非感染性的纳米颗粒，它能够自发地组装成类似于病毒的结构，从而模拟病毒的免疫原性。与传统的疫苗相比，VLPs具有以下几个显著的优势：
- 安全性高：由于VLPs不含有病毒的遗传物质，因此不会引起感染和疾病的传播，具有较高的生物安全性；
- 免疫原性强：VLPs能够以多聚体的形式将抗原呈递给免疫系统，从而有效地激活机体的免疫应答，产生高水平的抗体和细胞免疫反应；
- 生产工艺简单：VLPs可以通过基因工程技术在多种表达系统中进行生产，生产工艺相对简单，成本较低，易于大规模生产。
目前，VLPs已经在感染性疾病的预防和治疗方面取得了显著的成果。例如，乙肝病毒表面抗原VLPs和人乳头瘤病毒L1蛋白VLPs已经分别被开发成为预防乙肝和宫颈癌的疫苗，并在全球范围内得到了广泛的应用。然而，VLPs在癌症免疫治疗领域的应用还处于起步阶段。虽然已经有一些研究表明VLPs能够诱导机体产生抗肿瘤免疫反应，但在实际应用中还面临着许多挑战，如肿瘤抗原的选择和展示、免疫应答的强度和持久性等。
二、基于腺病毒的VLP的构建及特点
作者设计了一种基于腺病毒的VLP称为ADDomer，由12个来自人腺病毒3型的五邻体组成，其独特的结构使得它具有两个暴露的环，即可变环（Variable loop，VL）和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸环（Arginine-Glycine-Aspartic Acid Loop，RGD-L）。为了在ADDomer表面展示肿瘤抗原，作者采用了两种不同的方法。
如图1所示将来自OVA的主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex，MHC）I类表位（SIINFEKLTEWTSS，称为OT-I）和II类表位（ISQAVHAAHAEI NEAGR，称为OT-II）分别插入到RGD-L和VL环中，形成了ADDomer-Duo。这种方法简单易行，但对于较大的抗原表位可能会存在插入困难和表位折叠错误等问题。为了克服基因插入法的局限性，采用了一种基于蛋白质相互作用的共价连接技术，即SpyTag/SpyCatcher系统，可以将大的抗原蛋白与VLP表面的SpyTag进行特异性结合。作者将OVA蛋白（1-355）与SpyCatcher融合，形成了Blov-SC，然后通过与ADDomer表面的SpyTag进行结合，构建了ADD-ST/Blov-SC。
图1 ADD-Ø、ADD-Duo、ADD-OT-I和ADD-Blov的设计与表征
三、佐剂筛选实验
为了提高VLPs的免疫原性，作者进行了佐剂筛选实验。如图2B所示，选用三种佐剂MPLA（靶向cDC2）、poly（I：C）（靶向cDC1）和ODN 2395（靶向pDC），分别单独或联合使用对小鼠进行免疫接种。然后，通过检测小鼠脾脏和引流淋巴结中的免疫细胞反应以及血清中的抗体水平，来评估不同佐剂的免疫效果。
实验结果表明，poly（I：C）能够诱导最均匀的细胞和体液免疫应答，尤其是在引流淋巴结中，poly（I：C）能够显著提高OVA特异性CD8 + T细胞的频率，因此选择poly（I：C）作为后续实验的佐剂。
图2 ADD-Ø和ADD-Duo免疫原性评价及佐剂筛选
四、预防性疫苗实验
在佐剂筛选实验的基础上，作者进行了预防性疫苗实验。如图3A所示，将ADD-Duo与poly（I：C）混合后，对小鼠进行了5次免疫接种，每次间隔2-3天，并在最后一次免疫接种后25天用B16-OVA肿瘤细胞对小鼠进行攻击。通过观察小鼠肿瘤的生长情况，来评估预防性疫苗的免疫效果。
实验结果如图3C所示，免疫接种ADD-Duo的小鼠在肿瘤攻击后无肿瘤生长，而对照组小鼠则出现了明显的肿瘤生长。这表明ADD-Duo结合poly（I：C）能够有效地诱导机体产生抗肿瘤免疫反应，从而预防肿瘤的发生。
图3 预先接种过ADD-Ø和ADD-Duo的小鼠的肿瘤攻击实验
五、治疗性疫苗实验
为了评估ADDomer疫苗在治疗环境中的疗效，从肿瘤接种后1天开始，小鼠每2-3天接种5次ADD-Duo、ADD-OT-I和ADD-Blov疫苗（图4A）。如图4C和图4D所示，在第15天观察到接种ADD-Duo、ADD-OT-I和ADD-Blov的小鼠肿瘤明显小于接种ADD-Ø的小鼠。
图4 ADDomer 治疗性疫苗对B16-OVA肿瘤生长的影响
作者还对细胞反应进行了研究（图5和图6），结果显示，在脾脏中ADD-Duo组和ADD-OT-I组的OVA特异性CD8+T细胞频率比ADD-Ø组更高，而ADD-Blov组和ADD-Ø组之间的差异并不显著（图5A）。在肿瘤中，与ADD-Ø组相比，ADD-Duo组、ADD-OT-I组和ADD-Blov组的肿瘤浸润性OVA特异性CD8+T 细胞频率更高（图5A和5B）。
图5 短期免疫反应实验结果
图6 B16卵清蛋白表达的验证
如图7A所示，治疗性疫苗接种提高了所有接种组小鼠的存活率，特别是接种ADD-OT-I和ADD-Blov的小鼠组。个体肿瘤生长实验表明，所有肿瘤都得到了很好的控制，即使超过60天的随访，两组中只有1只小鼠逃脱了免疫控制（图7B）。
图7 治疗性疫苗的肿瘤生长和生存监测
六、ADDomer疫苗的优势与未来展望
6.1 ADDomer疫苗的优势
- 免疫原性强。ADDomer疫苗通过展示肿瘤抗原，能够有效地激活机体的免疫系统，诱导产生细胞免疫和体液免疫反应（图8）。其独特的结构和表位展示方式使得疫苗具有较高的免疫原性，能够针对肿瘤细胞产生特异性的免疫攻击。
图8 免疫小鼠对卵清蛋白抗原或表位的体液反应
克服免疫等位基因限制。通过展示大抗原而不是小表位，ADDomer疫苗能够克服免疫等位基因限制，拓宽免疫反应的范围。这对于开发通用型疫苗具有重要意义，因为它可以适用于不同人类白细胞抗原分型的人群，提高疫苗的适用性和有效性。
多种应用策略。ADDomer疫苗可以采用预防和治疗两种策略，在不同阶段对肿瘤进行干预。在预防阶段，疫苗能够诱导机体产生免疫记忆，预防肿瘤的发生；在治疗阶段，疫苗能够激活机体的免疫系统，对已经发生的肿瘤进行治疗，控制肿瘤的生长和扩散。
6.2 未来展望
未来的研究可以将ADDomer疫苗平台与其他治疗策略相结合，进一步提高癌症免疫治疗的效果。例如，可以将ADDomer疫苗与溶瘤病毒联合使用，利用溶瘤病毒的肿瘤裂解作用和ADDomer疫苗的免疫激活作用，实现协同治疗的效果。虽然本研究在小鼠模型中取得了令人鼓舞的成果，但将ADDomer疫苗应用于临床还需要进一步的研究和探索，需要进行临床试验，评估疫苗在人体中的安全性和有效性，为其临床应用提供依据。
结语
作者详细介绍了一种基于肿瘤抗原的腺病毒启发的VLP（ADDomer）在黑色素瘤免疫治疗中的应用。通过对小鼠黑色素瘤B16-OVA模型的研究，证明了ADDomer疫苗具有较强的免疫原性，能够有效地控制肿瘤的生长和扩散。其独特的表位展示方式和佐剂的合理使用是取得良好治疗效果的关键因素。未来，ADDomer疫苗有望与其他治疗策略相结合，进一步拓展其在癌症免疫治疗中的应用前景，为癌症患者带来新的希望。