手把手教学：TRIzol提取细胞RNA的详细步骤与注意事项
手把手教学：TRIzol提取细胞RNA的详细步骤与注意事项
TRIzol法是一种广泛应用于多种样品总RNA提取的技术，尤其适用于人、动物、植物和细菌等样本。该方法通过裂解细胞和组织样本，有效抑制RNase酶活性，从而保证RNA的完整性。提取的总RNA常用于RT-qPCR、mRNA纯化等实验。本文将详细介绍TRIzol法提取RNA的原理、实验步骤及注意事项。
TRIzol法提取RNA的原理
Trizol是一种广泛适用于多种样品总RNA提取的试剂，例如人、动物、植物和细菌、血液等。一般提取的总RNA没有DNA和蛋白质污染，常用于RT-qPCR、mRNA纯化等实验。广谱型Trizol含有异硫氰酸胍/酚，具有极强的裂解能力，可在短时间内裂解细胞和组织样本并有效抑制RNase酶活性从而保证RNA的完整性。其原理是Trizol中异硫氰酸胍、苯酚等不可逆地使蛋白质和RNase变性。随后进行离心。在酸性条件下，总RNA保留在上层水相中，而大部分DNA和蛋白质保留在中间相或下层有机相中。然后通过用异丙醇沉淀回收总RNA。在这个过程中，可利用吡咯碳酸二乙酯(DEPC)可灭活RNase酶，75%的酒精洗涤RNA沉淀，去除蛋白质，相关有机物的污染；最后用无核酶水溶解白色沉淀得到所需RNA。值得注意的是TRizol有毒，需在通风橱内操作，做好自我防护！！
实验步骤
以细胞6孔板为例：通常情况下，6孔板一般种100万/孔细胞左右，对于TRIZOL法而言，该细胞数目已经足够，但对于新手而言，该数目提取的RNA浓度可能较低，因此建议做浓度梯度或者时间梯度实为了保证RNA足够后续实验要求，因此建议在6孔板里面铺200万/孔细胞或者用6cm的中皿铺300万细胞。
（1）对于细胞铺板：一般情况下需要收集10cm的皿4个或者5个T25培养瓶，一般情况下细胞生长较好可能会有3000-4000万的细胞，多的有5000万（悬浮细胞）。以悬浮细胞为例，浆细胞收集至15ml离心管后，离心去上清，再用1-2ml新鲜培养基重悬细胞，通常会用1ml重悬。根据传统的细胞计数板估计细胞数目：
①将计数板和盖玻片擦干净，通常用酒精喷洗几次，将盖玻片盖在计数板上
②此时需要对细胞重悬液进行稀释，一般稀释10-20倍（20ul细胞悬液+180细胞培养基/20ul+380ul）
③计数板四个大方格细胞总数，压线细胞计左不计右，按照公式：细胞数/ml：4个大格子细胞总数/4 ×稀释倍数
例如：细胞重悬为2ml，稀释20倍，铺6孔板，每孔大约200万个细胞
则：四个大方格计数分别为36,38,39,48，则平均数为40.25，细胞数目为40.25×20×10^4即大约有805万个细胞/ml。
铺6孔板大约需要1200万个细胞/2ml，则将取样误差计算在内：1200/805≈1.5，最终取1.51ml=1510ul细胞加新鲜培养基至12.1ml，验证：(1.51×805)/12.1≈100万细胞左右，每孔取2ml。
（2）言归正传，目前使用RNA裂解液（TRIZOL）提取RNA：需要自备无核酶水（DEPC水），异丙醇，氯仿（目前一般用氯仿替代物），无水乙醇。主要注意事项是：保证无酶环境，在通风橱内操作！
1）贴壁细胞：先用PBS清洗细胞1~2次，六孔板对照组和实验组内各加1mlRNA裂解液或0.5ml完全覆盖细胞，吹打细胞使其裂解，并将细胞+RNA提取液转移至1.5mlEP管中（无酶），做好标记，室温静置5min左右；
- 向上述裂解液中加入1/5RNA裂解液体积的氯仿200ul(1ml)/100ul(0.5ml)，盖紧管盖，剧烈振荡15s左右，使两者充分混合，呈现乳浊状（RNA裂解呈粉红色），室温静置5min。
3）12000×g 4℃离心15min，样品分层：上层无色液体，中间层乳白絮状沉淀（尽量不要吸取到，可能会导致基因组DNA的污染），下层粉红色有机相，小心吸取上层无色液体至新的无酶EP管中，通常情况下，取小于RNA裂解液体积的60%约为500ul/200ul。
4）在新的EP管中加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温放置10min；
5）2000×g 4℃离心10min，去上清，出现白色胶状沉淀即RNA；
6）现配现用75%的乙醇（15ml离心管：11.25ml无水乙醇+3.75mlDEPC水/无RNase-free水），加入1.5ml离心管中，轻轻将沉淀弹起洗涤沉淀，7500g× 4℃。一般洗两次。
7）室温晾干5min左右，一般没有被挥发的液体为无核酶水。最后加入30-50ul（一般加入30ul），溶解沉淀。放置-80保存以供后续使用。
注意事项
1、上述步骤为常规提取RNA的步骤，前提是我们的细胞量足够，否则整个过程可能就非常考验“信念感”（很可能在异丙醇沉淀RNA这一步骤未有白色沉淀出现）：
（1）做过：6孔板每孔铺100万细胞，3孔并提最终RNA浓度可达1000多ng/ul，目前200万每孔RNA浓度稳定在300-500ng/ul(六孔板细胞铺板数目有限)；
（2）步骤3）中吸取水相时，尽可能大小移液枪交替使用，例如取500ul，可使用200ul、100ul、50ul等体积多次吸取，尽量不要吸取到中间的絮状沉淀。
2、异丙醇沉淀RNA这一步很关键，在我们离心后吸取丢弃上清时，在这一步之前我们有必要记住离心管放置的位置，例如离心管盖子方向统一朝外，根据离心方向，我们可以有选择吸弃上清，如下图所示。
3、值得注意的是75%的酒精现配现用，浓度过低洗涤不佳，还会导致RNA溶解，事实上第二次洗涤沉淀时我们也可以使用100%酒精，离心转速7500×g或不更换转速12000×g也可，洗涤次数不能偷懒，洗涤不干净可能会造成后期RNA浓度测定时蛋白质污染。
4、室温晾干RNA沉淀时，可以倒扣离心管在滤纸上或者放在通风橱内，放置时间不宜过长，时间过长会导致RNA不易溶解。
5、另外，TRIZOL法提取RNA可将细胞收集至离心管中即步骤（1）完成后，可将含细胞的RNA裂解液于-80冰箱保存保存月余。
6、通常为了节约试剂，减少用量，0.5ml的TRIZOL足够RNA的提取。