RNAi药物设计25年：从发现到临床上市，从诺贝尔到多适应症

RNAi药物设计25年：从发现到临床上市，从诺贝尔到多适应症

RNA干扰（RNAi）技术自1998年被发现以来，经过25年的发展，已经成为生物医药领域的重要研究方向。从基础研究到临床应用，RNAi技术在遗传性疾病、病毒感染、肿瘤等多种疾病的治疗中展现出巨大潜力。本文将为您详细介绍RNAi药物的设计原理、递送策略及其临床应用现状。

1998年，Andrew Fire和Craig Mello首次描述了RNAi现象，他们在实验中发现双链RNA（dsRNA）可以特异性地抑制在秀丽线虫中相应基因的表达，这一发现最终为他们赢得了2006年的诺贝尔生理学或医学奖。

在RNAi被发现后的25年里，这种转录后基因调控机制为疾病的治疗提供了新的可能性。目前RNAi药物的研发逐步进入临床试验阶段，例如，用于治疗遗传性ATTR淀粉样变性的Patisiran，这是第一个获得FDA批准的基于RNAi的治疗药物，于2018年上市。同时更多基于RNAi的药物正在开发中，针对各种疾病，如病毒感染、肿瘤和遗传疾病等。

图1：RNAi从发现到临床应用的25年

合成小干扰RNA（siRNA）通过触发RNAi，具有特异性沉默几乎任何治疗靶点的潜力，拥有前所未有的效力和持久性。当然将这一类创新药物带给患者面临着诸多挑战（比如递送问题），需要持续的进行创新。

宏观上看来，随着研究的深入和技术的进步，RNAi也将在生物医药领域扮演越来越重要的角色。

RNAi的关键步骤及参与者

通过RNAi降解目标mRNA或抑制其翻译的过程涉及多个关键步骤和分子参与者：

1. 触发分子的产生：RNAi通常由dsRNA触发，这些dsRNA可以来源于病毒，也可以是基因表达过程中产生的自然副产品，或者是实验室合成介入，在一些情况下，小的发夹RNA（shRNA）或微小RNA（miRNA）也可以引发RNAi机制。
2. dsRNA的处理：dsRNA首先被DICER酶切割。DICER是一种核糖核酸酶，能够将长的dsRNA切割成约21-25个核苷酸长的siRNA，siRNA是双链的，含有一个乘载链（guide strand）和一个乘客链（passenger strand）。
3. RISC装载：siRNA被纳入到RNA诱导的沉默复合体（RISC）中，在这个过程中，乘客链被降解，而乘载链被保留在RISC中。RISC是一个多蛋白复合体，其核心成分之一是Argonaute蛋白，具有内源性的核酸内切酶活性。
4. mRNA识别与降解：装载有siRNA的RISC复合体通过siRNA的乘载链与目标mRNA序列特异性结合。乘载链作为模板，识别并与互补的mRNA序列进行杂交。一旦RISC成功与目标mRNA结合，Argonaute蛋白就会切割mRNA，从而抑制其表达。这种切割发生在siRNA与mRNA杂交的区域。
5. 翻译抑制与基因沉默：除了通过切割mRNA使其降解外，RNAi机制还可能通过阻止mRNA的翻译来抑制基因表达。在某些情况下，即使mRNA没有被完全降解，RISC的存在也能阻碍翻译机制，从而降低蛋白质的产量。

siRNA设计的化学修饰策略

未修饰的 siRNA代谢稳定性较差，容易在体内立即降解（一分钟内降解 >50%），双链 siRNA 还可以触发先天免疫反应并引起脱靶效应。

目前通过引入某些 2′-核糖和末端骨架修饰，包括 2′-OMe、2′-F和硫代磷酸盐（PS），这些问题在很大程度上得到了解决。为了提高siRNA的稳定性、特异性和递送效率，研究者们开发了多种化学修饰策略。这些修饰能够保护siRNA不被降解、减少免疫反应并增强其在体内的生物利用度。

一些常见的siRNA化学修饰策略包括：

1. 磷酸二酯骨架修饰：此类修饰目的在于提高基础的骨架稳定性，包括硫代磷酸盐（Phosphorothioate, PS）和甲基膦酸酯（Methylphosphonate, MP）修饰。PS将磷酸二酯骨架中的一个非桥氧原子替换为硫原子，提高siRNA的稳定性和抗核酸酶降解能力。MP通过在骨架中引入甲基膦酸酯基团，增加siRNA的稳定性。
2. 核糖修饰：第一种方式是2'-O-甲基（2'-O-methyl, 2'-OMe），在核糖的2'位引入甲基，增加siRNA的抗降解能力，同时减少免疫反应。2'-氟代（2'-Fluoro, 2'-F）也是一种有效的修饰方式，其在核糖的2'位引入氟原子，能够显著提高siRNA的稳定性。此外还有锁核酸（Locked Nucleic Acid, LNA）方法，通过在核糖环上引入一个额外的桥环，使核酸处于锁定构象，提高了结合亲和力和稳定性。
3. 末端修饰：末端修饰策略包括5'端修饰和3'端修饰，在5'端引入磷酸基团、脂质分子或荧光团，或者在3'端添加氨基、硫醇或脂质分子，可以增强siRNA的稳定性或实现可视化追踪，以及细胞膜穿透能力（3'端修饰）。
4. 核苷酸碱基修饰：假核苷（Pseudouridine, Ψ）和2-硫代尿苷（2-thiouridine, s2U）等修饰，可以增强siRNA的稳定性并降低免疫反应。
5. 脂质和聚合物修饰：脂质修饰如胆固醇修饰，可以提高siRNA的细胞摄取效率和血清稳定性。聚乙二醇（Polyethylene Glycol, PEG）修饰则是通过将PEG链连接到siRNA上，增加其水溶性和循环时间，减少免疫反应。
6. 其他化学修饰：在siRNA中引入部分DNA片段，形成脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid, DNA）嵌合体，以提高稳定性和减少脱靶效应。此外还有烷基化修饰如烷基磷酸酯修饰，以增强siRNA的抗降解能力和细胞摄取效率。

调整siRNA的全局支架对其功能具有重要意义，通过2′-OMe、2′-F、PS和5′-VP修饰能够实现支架的最佳配置，能够有效地形成RISC、导链载荷和目标识别。这些化学修饰策略为siRNA在基因沉默和治疗应用中的有效性和安全性提供了重要保障，通过不断优化这些修饰技术，siRNA在临床应用中的潜力也将不断增加。

图2：siRNA药物作用机制

计算机设计与生物筛选

siRNA药物的设计需要对遗传信息进行全面分析，包括mRNA表达谱、单核苷酸多态性（SNP）的存在、序列特异性和同源性。

生物信息学可以帮助我们在实验验证之前预测 siRNA 的功能、特异性和跨物种靶向性，最终提高 siRNA 先导化合物鉴定的成功率。而多种因素会影响siRNA的治疗效果，有些很容易预测，可信度很高，而另一些则需要大量的实验筛选，因此通常需要联合方法才能确定最佳 siRNA 序列。

影响生物信息学在预测高功能siRNA方面整体性能的关键因素包括以下几种。

1. siRNA修饰与未修饰的影响。上文我们提到siRNA的化学修饰对于提高其功能性的重要性，但是大多数公开可用的 siRNA 预测算法都基于未经修饰的 siRNA 数据集，这就限制了它们预测修饰 siRNA 的能力。目前的预测方法都比较有限，基于修饰的siRNA开发的算法对未修饰的化合物仍然没有显示出显著的预测能力。
2. siRNA在体外与体内的效力。化合物的最佳临床疗效高度依赖于效力，而效力可能因化学修饰和递送实体而有很大差异。体外、体内和临床效力之间的确切关系因为现有数据通常不匹配可能难以解决，尤其是在序列、修饰模式和给药方案发生变化的化合物中。超功能序列有据可查，但对驱动超功能的因素及其预测的信息学的基本理解尚未得到很好的建立。目前的大多数临床先导物都靶向 3' 非翻译区 （UTR），这些区域富含 miRNA 结合位点，为增强基因沉默的局部环境提供了更高的机会。尽管已经探索了许多方法来提高预测准确性，但计算输出与实际运用之间的相关性仍然有限，这主要是由于生物学的复杂性，机器学习方法的使用可以帮助识别序列、修饰和功效之间的模式或相关性，或将推动功能性 siRNA 信息学的发展，而前提是需要在一致的实验条件下从生物学验证中获得大规模、高质量的数据集。
3. 特异性。靶点特异性是需要考虑的关键因素，脱靶现象的存在使得信息学筛选的准确性受到进一步挑战，由于脱靶而产生的毒性在体内与体外仍然存在差异，据报道，与体外相比，siRNA的脱靶miRNA样调控在体内似乎问题不大，不会产生毒性，这是十分庆幸的一点，但体内组织与细胞类型的差异仍然是需要考虑的因素。
4. 跨物种靶向性。具有跨物种靶向性的siRNA可以简化并加快候选药物从临床前开发到临床试验的转化，而鉴定此类 siRNA 需要对人类与目标物种之间靶序列的同源性进行分析。转录本的初始比对常用的数据库有NCBI BLAST、Ensembl 和 UCSC Genome Browser。通常情况下人类和实验物种之间的转录组学存在一定程度的差异，因此进行预测以尽量减少两个物种的脱靶效应是具有挑战性的。目前关于介导跨物种活性差异的生物学机制仍然知之甚少且可能是多因素共同调控的，而完全解决这些挑战的计算工具目前还没有被设计出来。

siRNA的递送优化策略

siRNA 向靶组织或细胞类型的功能递送受多种因素的影响，包括给药途径、生物屏障、外渗、组织或细胞摄取和内体逃逸。

LNP 和偶联物是临床批准的 siRNA 递送方法，目前，偶联介导的递送是临床上siRNA递送的主要平台。在 LNP 和 GalNAc 介导的肝脏递送的开发后，当前适合递送的组织正在扩大，对于非肝组织，中枢神经系统（CNS）、眼睛、肺、肌肉和皮肤显示出有希望的进展；其他组织包括肾脏、心脏、脂肪、胎盘和胰腺，也正在探索中。这种扩张主要归因于递送平台和管理模式的创新。虽然使用 GalNAc 偶联物选择性地将 siRNA 递送至肝脏很简单，但选择性递送至 CNS、眼睛、肺和皮肤是通过局部给药实现的。全身给药用于到达肌肉、肾脏、心脏、脂肪、胎盘和胰腺，尽管不是选择性的，但siRNA能够优先以可接受的剂量水平在这些组织的某些细胞类型中积累。

表1：在各种组织中实现治疗性RNAi的递送技术

尽管肝脏是siRNA治疗的主要靶器官，但将siRNA递送到肝外组织仍然是一个重要的研究方向。为了实现这一目标，研究者们开发了多种先进的递送系统，包括靶向递送系统（靶向配体修饰和特异性受体介导的内吞）、非病毒递送载体（纳米颗粒、聚合物载体以及无机纳米材料）、细胞穿膜肽（Cell-Penetrating Peptides, CPPs）（TAT肽）、其他CPPs（Penetratin和Arginine-rich peptides）、工程化外泌体递送以及联合递送策略（多功能纳米载体和局部递送策略）。这些策略提高了siRNA的递送效率和靶向性，已经成熟应用于各领域的研究，比如利用表皮生长因子受体（EGFR）靶向纳米颗粒递送siRNA，用于中枢神经系统疾病的研究；使用PSMA（前列腺特异膜抗原）靶向的siRNA纳米载体，用于前列腺癌的治疗；通过脂质纳米颗粒递送siRNA，靶向心肌细胞，研究心脏病相关基因的功能。随着新材料、新技术和新策略的不断发展，siRNA的肝外递送将会更加高效和安全，进一步扩大其在基因治疗中的应用范围。

图3：siRNA结构修饰策略

RNAi疗法已批准及临床药物

RNAi疗法近年来在临床研究中取得了显著进展，一些关键的临床进展和已获批准的siRNA药物包括：

已获批准的siRNA药物

a. Patisiran（Onpattro）：由Alnylam Pharmaceuticals开发，用于治疗遗传性甲状腺素转运蛋白淀粉样变性（hATTR）。这是第一个获FDA批准的siRNA药物，通过脂质纳米颗粒（LNP）递送siRNA。
b. Givosiran（Givlaari）：同样由Alnylam开发，用于治疗急性肝卟啉病（AHP）。它通过直接抑制ALAS1基因的表达，减少有害代谢物的生成。
c. Lumasiran（Oxlumo）：用于治疗原发性高草酸尿症1型（PH1），通过抑制Hao1基因表达，减少草酸盐的生成。
d. Inclisiran（Leqvio）：由Novartis开发，用于治疗高胆固醇血症，通过抑制PCSK9基因的表达，降低低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平。

临床试验中的siRNA药物

a. Vutrisiran：用于治疗hATTR，目前正在进行III期临床试验。
b. Fitusiran：用于治疗血友病，通过靶向抗凝血酶（AT）来增加凝血因子水平。
c. Nedosiran：用于治疗原发性高草酸尿症，通过靶向LDH基因来减少草酸盐的生成。

图4：siRNA药物未来应用前景

RNAi临床发展方向事实上也已明了：

首先要考虑扩展适应症，包括神经退行性疾病如阿尔茨海默病和帕金森病，通过靶向相关致病基因，调控神经炎症和蛋白质错误折叠。以及向癌症治疗方向发展，靶向肿瘤相关基因或信号通路，如PD-L1、VEGF等，增强免疫应答或抑制肿瘤血管生成。此外还有罕见遗传病治疗方向，通过精准靶向致病基因，提供新的治疗方案，如杜氏肌营养不良症（DMD）、囊性纤维化（CF）等。

然后改进递送系统，开发更有效的递送系统，将siRNA递送到肝外组织和器官，如心脏、肺部、肌肉等，提高治疗范围。开发生物相容性更好的聚合物、无机纳米颗粒和外泌体等，增强siRNA的稳定性和递送效率。开发局部给药途径如皮下注射、肌肉注射、鼻腔喷雾等，减少全身副作用，提高靶向组织的药物浓度。

然后探究降低脱靶效应和免疫反应的策略，做到使用生物信息学工具精确设计siRNA序列，以及通过化学修饰减少siRNA引发的免疫反应，提高其在体内的稳定性和安全性。

最后是联合疗法的运用，与传统小分子药物或生物制剂联合使用，增强治疗效果，降低耐药性；与基因编辑技术如CRISPR-Cas9系统联合使用，提供多层次的基因调控手段，实现更精准的治疗。

图5：临床适应症和靶点选择

随着技术的不断进步和对siRNA生物学机制的深入了解，siRNA疗法在临床上的应用前景广阔。未来，siRNA有望在更多的疾病领域展示其治疗潜力，尤其是在难治性和罕见病治疗方面。同时，通过优化递送系统和降低副作用，siRNA疗法将变得更加安全和有效，为患者带来更多的治疗选择。

参考文献：

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