实验技巧：蛋白质浓度测定之BCA法

实验技巧：蛋白质浓度测定之BCA法

蛋白质浓度测定是生物化学和分子生物学实验中常见的需求，其中BCA法（二辛可酸法或二喹啉甲酸法）是最常用的方法之一。本文将详细介绍BCA法的原理、操作步骤、优缺点以及注意事项，帮助读者更好地掌握这一实验技术。

蛋白质浓度测定是用于计算纯化方法的回收率的重要方法。常用的测定方法包括双缩脲法、Lowry法、紫外吸收法、BCA蛋白浓度检测法等。其中最常用的方法就是BCA法（二辛可酸法或二喹啉甲酸法）。BCA 全称是Bicinchoninic Acid Assay， 也叫Smith Assay，这个方法是由Paul K. Smith 发明的。这个方法通过展示不同浓度样品的颜色变化来判断蛋白的浓度。

BCA法是Lowry法的一种改进方法。与Lowery法相比，BCA法操作起来更加简单方便，其试剂及其形成的颜色络合物稳定性更好，几乎不受其他干扰物的影响，并且灵敏度高（微量检测可达到0.5ug/ml），应用起来更加灵活。BCA法与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂（SDS，Triton X-100，Tween-20等）的影响。

BCA法蛋白定量的原理

BCA是一种稳定的碱性水溶性复合物。在碱性条件下，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，Cu+与独特的BCA Reagent A（含有BCA）相互作用产生敏感的颜色反应，形成紫色的络合物。该水溶性的复合物在A562 nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白质浓度在广泛范围内有良好的线性关系，根据吸光值可以推算出蛋白浓度。因此，使用酶标仪测定其在A562 nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。

BCA法蛋白定量的操作步骤

方法1：孔板法

a. BCA工作液配制。根据标准品和样品数量，按50体积BCA Reagent A加1体积BCA Reagent B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀。

b. 标准曲线绘制。取一块酶标板（酶标板的板底是不能用手去触碰的，一般拿的是侧壁），按下表数据加入试剂：

c. 样品准备：将待测蛋白样品用去离子水稀释至适当浓度，取20 ul样品，加入200 ul BCA工作液（蛋白液：工作液=1:20）。加样时枪要轻柔吹打，将其中液体混匀。（TIPS：尽量小一点力气轻柔一点，不要弄出很多气泡，不然气泡会影响读数。）

d. 振荡混匀后，37℃放置20 ~ 30 min。冷却至室温。颜色变化如下图：

e. 用酶标仪测定A562 nm处的吸光值，以不含BSA的吸光值为空白对照。

f. 以蛋白含量(ug)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线。

g. 根据测得的吸光值，在标准曲线上即可计算出样品的蛋白含量。

h. 计算蛋白浓度：以查得的蛋白含量除以样品体积20 ul，再乘以相应的稀释倍数即可得到待测样品的实际浓度。

方法二：试管法

a. BCA工作液配制。根据标准品和样品数量，按 50 体积BCA Reagent A加1体积BCA Reagent B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀。

b、选取7支洁净试管，其中6支标号1~6号管（包含第1支空白管），另外1支标记待测管。按照下表用移液器准确移取相应的标准蛋白溶液或待测样品、蒸馏水和BCA工作液于试管中。

c、 取适量体积的标准蛋白（根据情况用去离子水适度稀释），以蛋白液：工作液=1:20 的比例混匀。37 ℃ 温浴 30 min。冷却至室温。

d、然后吸取各试管中的溶液于比色皿中并用分光光度计的562nm波长比色测定吸光度值。

操作示意图如下：

所绘标准曲线如下：

图表标题中可显示出公式和 R2值来。一般 R2值越接近 1代表你的标准曲线做得越好。根据标准曲线带入的样品蛋白浓度也越准确。R2值越接近 1 越好，一般要求为 0.99几左右（本实验室要求R2＞0.995以上）。

BCA法的优缺点

优点：

1、此方法被广泛选用，操作简便、快速，45分钟内即可完成测试。比经典的Lowery法快4倍且更加；

2、不易受一般浓度去污剂、尿素等影响，抗干扰能力强；

3、检测不同蛋白质分子的变异系数也远小于考玛斯亮蓝法；

4、准确，灵敏度高，试剂稳定性好。BCA法在20-20 ug/mL浓度大范围内具有良好的线性关系，微量BCA测定范围在0.5-10 ug/ml。

5、经济实用，除试管外，测定可在微板孔中就进行，大大节约样品和试剂用量；

缺点：

1、可能会受螯合剂（EDTA、EGTA）和高浓度还原剂（DTT、β-巯基乙醇）的影响；

2、需要30分钟或者更长时间的恒温水浴孵育反应。

总结

在蛋白质浓度测定中，一般根据蛋白裂解液的成分选择相应的蛋白质浓度测定方法。如果裂解液中有含有高浓度还原性试剂或螯合剂，则BCA法不适用浓度测定。总之，虽然蛋白质含量的测定方法很多，但是，还没有一个完美的方法。在选择测定方法时，可根据实验要求和实验室条件决定。

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