三代纳米孔测序优势分析1-1

三代纳米孔测序优势分析1-1

原理回顾
三代测序也称为纳米孔链测序法，是指将单个核酸分子在电场力驱动和马达蛋白控速的双重作用下，以连续的单链核酸形式穿过纳米尺寸的蛋白孔道，当不同碱基通过时，会对孔道内的离子电流产生不同程度的阻断，因此可以通过捕捉随时间变化的电流信号实时地识别其碱基排列信息，从而实现对单链核酸分子的测序。
产品优势
长读长
1，超过150Kb 甚至到 Mb的长读长
从原理上，三代和二代测序使用的技术有着本质差别，三代纳米孔测序的读长不受限于测序设备或芯片。完全看溶液中的DNA/RNA有多长，它就通过多长：
根据纳米孔测序的原理，DNA/RNA的读长多长（最小测序单元的测序长度）完全决定于输入片段多长。目前普遍可以做到读长超过超过150个碱基 甚至到 10^6 个碱基的超长读长。

而二代测序，华大的纳米球技术、illumina的DNA簇技术都有读长的限制，如illumina的 DNA 簇技术，如下图，这个簇的长度是有限制的，是通过桥式PCR技术生成的：
如华大的纳米球（DNB=DNA Nano Ball）技术：

说到纳米球（DNB=DNA Nano Ball）技术，这个东西像毛线团一样看起来很长很长啊，为什么说它也是短读长呢？很多初学者有点难以理解，如下图，其实它使用了滚环复制技术，没复制一圈（PCR）的长度就是它的读长。

因此华大芯片上的纳米孔内的毛线球，应该长得像黑人小哥的方便面头。

不管是DNA簇还是DNA纳米球，他们的生成都依赖于PCR过程，然后对DNA簇还是DNA纳米球的测序过程也依赖于一轮一轮的PCR过程（加一种碱基发出一种光），受限于这种程序化的底层原理，华大和illumina都是属于短读长技术。
如下图，illumina NextSeq 550 ，读长最长是150bp，双端测序的话，读长可以到600bp，实际上无非是：

不同的仪器能使用的芯片也不同：

如下图，华大明星产品G99 芯片选择：
有心人可能就会问了，不管是纳米球还是DNA簇，它的母链是从何而来的呢？答案是，需要用 超声打断仪或酶 进行前处理，总之要么是机械的暴力方式，或者是生化武器的暴力方式。
如下图，比利时知名品牌 Bioruptor Pico全自动超声波破碎仪：
为了得到这种超短的DNA片段，不管是酶法还是超声法，都各有优缺点：
酶法打断: 用限制性内切酶特异性识别并切割磷酸与脱氧核糖之间的化学键，需要控制酶切时间和酶量。优势：高通量可一次性做多个样本，易操作；劣势：偏好性严重，对样本的质量要求严苛。
超声波打断:自适应聚焦声波在样本中造成气穴现象从而机械随机的切断DNA，长片段的DNA，受到的剪切力比较大。优势：片段随机打断，无偏好性。劣势：成本高，机械损伤大。
目前普遍采用超声打断法，因为测序的质量更重要（什么叫偏好，后面有机会再讲）。但是目前的超声打断仪没有那么智能，样本溶液里的基因组也没有那么听话，会乖乖的按照你的设定，统一都打断成某个长度，如果是进口品牌，无非是在合适的参数设定下，能量更加集中，设计更加巧妙，打断的基因组的长度更加集中于设定的长度而已。
比如读长PE150，需要打断片段设置成平均长度300-500bp，但这时候片段长度仍是正态分布的。
然后按照NGS建库的原理，需要加接头，那加上接头后的片段难道就继续往下使用吗？是不行的，浪费试剂，也最终浪费芯片里面的纳米孔坑位啊，因此需要使用神奇的磁珠，来优选想要的片段范围，筛选后片段的分布范围会更狭窄，可以通过电泳或者生物分析仪（安捷伦或厚泽）来测试：
上图是我自己脑子里想象的，实际300-500bp这一段在总核酸中的比例，其实没有这么大。在查资料过程中，作者：SYSU星空 在 公众号“微生态与微进化”上的一篇文章里面有一个更直观的数据：微生物基因组DNA经过90s超声波打断成约350bp的小片段，建库后的文库片段（加上接头为500bp左右）经Agilent 2100测试长度分布如下所示：
上图中间那个大峰左侧虚线是505bp，右侧是531bp，间隔26bp，虽然300-500的范围标志线在这个图没有标，但是读者们是可以想象的，（500-300）/26≈8，即大峰中间那个细细的柱子子，再往左边复制7根，这8根柱子内的DNA，才是真正希望用磁珠回收的。剩下的DNA，都没有用，貌似浪费挺多的。
因此可以想象的是，这么一系列操作后，消耗了大量的人力、物力、时间（后面会讲到底层原理带来的流程差异），也浪费了很多的样本DNA，DNA更是受了老大罪了，打得越碎，伤害越大。如果是一些精贵的样本，那还是蛮担忧的，比如单细胞测序？比如时间放得比较长的FFPE标本（本身DNA已经是受伤了（降解））。
两相对此，三代测序的优势显而易见，因为三代测序对于片段的需求是反着来的。
三代测序可以使用直接测序，即DNA提取后，未经过片段筛选的过程，直接进行建库测序。
但是这种方式不是最优化的办法，特别是对于大基因组的样本，相当于一根超长的火车要通过一个隧道，会占用大量的时间，直接的结果就是测序的数据产量会低。如下图，三代测序的测序读长最长是在 10^6 bp的量级，对于除了病毒之外的绝大多数的样本，直接测序不是最好的选择。
因此大多数情况下，也需要对基因组进行片段打断然后测序，以提高数据产量；三代测序的片段打断就相当简单，比如可以利用g-TUBE（一种特制的离心管，离心转速越快，片段越小）将DNA片段简单离心就可打断成20kb或其它大小的片段。
当然，接下来也需要富集大片段、抛弃小片段，才能进行高质量的测序，但是总体来看，g-tube的小片段浪费较小，对DNA的伤害也较小。如果控制好离心条件，使用bluepippin这样的仪器来卡着峰的底部左侧来回收整个峰的大片段，是较为方便的。
当然可以使用转座复合物快速建库，那速度就更快了。后面会再讲到。
End
注：初次学习三代测序，如有错误，欢迎指正，非常感谢。
下文预告：三代纳米孔测序优势分析1-2，会讲到长读长的其他好处，放个繁花的截图作为引子：