天然水蛭素对人微血管再生作用的初步研究
天然水蛭素对人微血管再生作用的初步研究
水蛭素是水蛭的主要活性成分，具有抗凝血、抗炎和促进血管生成等作用。近年来，研究发现水蛭素可以通过调节VEGF-Notch信号通路，促进微血管内皮细胞增殖和血管再生。本文通过体外三维培养模型，探究了不同浓度天然水蛭素对人微血管内皮细胞（HMVECs）增殖和血管再生的影响及其机制。
实验目的
研究天然水蛭素对人微血管内皮细胞（human microvascular endothelial cells，HMVECs）增殖的影响及其诱导血管再生的机制。
实验方法
取 HMVECs 接种至 Matrigel 基质胶培养 24 h，体外建立三维培养模型，于倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。然后将细胞三维培养模型随机分为不同浓度天然水蛭素培养组（1、4、7 ATU/mL 组）以及单纯含 10%FBS 的 DMEM 培养基培养组（对照组）。各组细胞三维培养模型加入对应培养基后，培养 24、48、72 h 采用细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）检测细胞增殖情况；培养 24 h 行成管实验并采用免疫荧光染色法测定细胞 VEGF 及 Notch1 表达水平。
实验结果
细胞三维培养观察示，HMVECs 于基质胶上贴附良好，24 h 时完全形成管腔样结构。CCK-8 检测示，各时间点 1、4 ATU/mL 组A值均高于对照组（P<0.05），其中 4 ATU/mL 组最高；而 7 ATU/mL 组A值显著低于对照组以及 1、4 ATU/mL 组（P<0.05）。细胞成管实验示，1、4 ATU/mL 组成管数量较对照组及 7 ATU/mL 组明显增多，且 4 ATU/mL 组多于 1 ATU/mL 组，差异有统计学意义（P<0.05）；7 ATU/mL 组与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。免疫荧光染色示，与对照组比较，1、4 ATU/mL 组 Notch1 表达量增高，7 ATU/mL 组降低；其中 4、7 ATU/mL 组与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。1、4、7 ATU/mL 组 VEGF 表达量均较对照组增高，4 ATU/mL 组高于 1、7 ATU/mL 组，差异均有统计学意义（P<0.05）。
实验结论
低、中浓度天然水蛭素可促进 HMVECs 增殖使血管再生，高浓度天然水蛭素则对 HMVECs 增殖及血管再生起抑制作用；其作用机制可能与 VEGF-Notch 信号通路有关。
材料与方法
主要试剂及仪器
HMVECs 购自北京北纳创联生物技术研究院。天然水蛭素（南宁市净雪皇生物工程有限公司）；Matrigel 基质胶（Corning 公司，美国）；VEGF 抗体、Notch1 抗体（Abcam 公司，英国）；H-DMEM 培养液、FBS（Thermo Fisher 公司，美国）；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；Dojindo 公司，日本）。
血管生成载玻片（Ibidi 公司，德国）；超净工作台、细胞培养箱（Thermo Fisher 公司，美国）；低温高速离心机（Eppendorf 公司，美国）；倒置相差显微镜（Leica 公司，德国）；37℃ 温水浴箱（宁波新芝生物科技股份有限公司）；酶标仪（Synergy 公司，美国）；倒置荧光显微镜（Olympus 公司，日本）。
实验方法
细胞三维培养模型制备及分组
取 Matrigel 基质胶 4℃ 过夜后，转移至血管生成载玻片，每孔 10 μL，置于 37℃ 培养箱 20 min，使液态基质胶凝固。取 HMVECs 以胰蛋白酶消化后，采用含 10%FBS 的 DMEM 培养基制成密度为 2×105个/mL 的细胞悬液，并充分混匀；将已成胶的血管生成载玻片置于冰上，每孔接种 50 μL 细胞悬液后，置于 37℃、5%CO2培养箱中培养 24 h，制备细胞三维培养模型，倒置相差显微镜下观察细胞成管情况。
取细胞三维培养模型，随机分为不同浓度天然水蛭素培养组（1、4、7 ATU/mL 组）以及单纯含 10%FBS 的 DMEM 培养基培养组（对照组）。各组细胞三维培养模型加入对应培养基后，置于 37℃、5%CO2培养箱中培养，于相应时间点取标本进行观察。
CCK-8 细胞增殖实验
培养 24、48、72 h 后，各组取 6 个复孔分别加入 5 μL CCK-8 溶液，继续培养 2 h 后，用酶标仪测定 450 nm 处吸光度（A）值。以无细胞的单纯培养基作为空白对照。实验重复 3 次。
细胞成管实验
培养 24 h 后，各组取 6 个复孔，倒置相差显微镜下观察细胞成管情况，并应用 Image J 软件计数成管数量。
免疫荧光染色测定 VEGF 和 Notch1 表达
培养 24 h 后，各组取 6 个复孔，细胞回收液收集细胞并接种至细胞爬片。细胞爬片用 PBS 浸洗 3 次，每次 3 min；4% 多聚甲醛固定 15 min，PBS 浸洗；0.5%TritonX-100 室温通透 20 min。滴加正常山羊血清封闭后，滴加稀释的一抗（VEGF、Notch1）、4℃ 过夜；滴加荧光二抗，1 h 后 PBST 洗 2 次、每次 2 min；滴加 DAPI 复染，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片。最后，置于荧光显微镜下观察，呈绿色荧光为阳性染色细胞。
统计学方法
采用 SPSS25.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准α=0.05
实验结果
细胞三维培养模型构建观察
HMVECs 接种至基质胶三维培养至 24 h 时，细胞基本形成血管腔隙结构，形态规则，成管情况较好。见图 1。
三维培养 24 h 后倒置相差显微镜下观察 HMVECs （×200）
CCK-8 细胞增殖实验
各时间点，1、4 ATU/mL 组A值均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），提示该浓度天然水蛭素促进细胞增殖。其中，24 h 时 4 ATU/mL 组A值高于 1 ATU/mL 组，差异有统计学意义（P<0.05）；而 48、72 h 时两组A值比较差异无统计学意义（P>0.05）。各时间点，7 ATU/mL 组A值显著低于其他 3 组，组间差异均有统计学意义（P<0.05），提示该浓度天然水蛭素抑制细胞增殖。见图 2。
CCK-8 检测 HMVECs 生长曲线
细胞成管实验
培养 24 h，对照组及 1、4、7 ATU/mL 组成管数量分别为（3.33±0.57）、（5.66±1.52）、（9.33±1.15）、（3.00±1.00）个。1、4 ATU/mL 组成管数较对照组及 7 ATU/mL 组明显增多，4 ATU/mL 组多于 1 ATU/mL 组，差异有统计学意义（P<0.05）。而 7 ATU/mL 组与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见图 3。
各组细胞成管实验观察（倒置相差显微镜×100）
a. 对照组；b. 1 ATU/mL 组；c. 4 ATU/mL 组；d. 7 ATU/mL 组
细胞 VEGF 和 Notch1 表达测定
荧光染色检测示，对照组及 1、4、7 ATU/mL 组 Notch1 表达量分别为 181.33±6.65、183.33±7.50、263.00±7.93、141.00±8.88。与对照组比较，1、4 ATU/mL 组 Notch1 表达量增高，7 ATU/mL 组降低；其中 4、7 ATU/mL 组与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05），1 ATU/mL 组与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）；1、4、7 ATU/mL 组间比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 4。
各组 Notch1 免疫荧光染色观察（倒置荧光显微镜×200）
a. 对照组；b. 1 ATU/mL 组；c. 4 ATU/mL 组；d. 7 ATU/mL 组
对照组及 1、4、7 ATU/mL 组 VEGF 表达量分别为 88.60±5.50、184.00±11.53、283.33±16.16、176.33±9.71。1、4、7 ATU/mL 组 VEGF 表达量均较对照组增高，差异有统计学意义（P<0.05）；4 ATU/mL 组高于 1、7 ATU/mL 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；而 1、7 ATU/mL 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 5。
各组 VEGF 免疫荧光染色观察（倒置荧光显微镜×200）
a. 对照组；b. 1 ATU/mL 组；c. 4 ATU/mL 组；d. 7 ATU/mL 组
讨论
国内外研究已证实，水蛭素可以改善动物微循环，但其改善血运的机制尚不清楚。1992 年 Donayre 等[13]的研究证实水蛭素抗凝作用远优于肝素，其作用不依赖凝血酶Ⅲ，可以直接与凝血酶结合，特异性强。而凝血酶有致炎作用，Huang 等[14]研究发现 EGFR 是凝血酶导致炎症的重要调节点。近年在肿瘤学领域，Turpin 等[15]和 Xu 等[16]发现凝血酶具有通过炎性反应促进肿瘤生长的作用，因此反向分析水蛭素可能是通过拮抗凝血酶抑制各种炎性因子。结合国内外文献和本课题组前期研究结果，我们分析水蛭素除了通过拮抗凝血酶起到抗炎作用外，可能还具有直接促进微血管再生的作用。
本课题组既往研究主要采用鼠皮瓣淤血模型，本次改用细胞三维培养技术。主要原因为，传统单层培养细胞在体外环境会逐渐丧失原有性状，不能产生体内细胞外基质屏障，生长特性与体内差异较大[17]。而动物实验虽在体内进行，但由于体内多种因素制约以及体内和外界环境相互影响，不能观察中间细胞生长过程，其为研究重点关注内容。而细胞三维培养技术能模拟人体内微环境，培养细胞呈立体生长，更接近于人体内自然生长环境[18]，填补了单层细胞培养和动物实验的不足[19]。近年来，国内外一些研究者已通过各种细胞三维培养模型来研究人类疾病的发生发展规律[20]。
VEGF-Notch 信号通路是经典的促血管生成分子通路，可以使人多功能干细胞分化成 HMVECs[21]。本实验采用细胞三维培养模型，通过细胞增殖实验、成管实验和免疫荧光染色直接测定水蛭素作用下 HMVECs 的 VEGF、Notch1 表达情况，结果提示天然水蛭素可能通过上调 VEGF-Notch 信号通路，促进细胞增殖和微血管形成。同时，我们也观察到这种促进作用仅在 1、4 ATU/mL 浓度时明显。随着药物浓度的增加，VEGF-Notch 信号通路表达量开始下降并逐渐转向抑制，且高浓度水蛭素明显抑制细胞增长，分析可能与高浓度水蛭素开始表现抗炎作用有关。当水蛭素表现抗炎作用抑制各种炎性因子释放时，也抑制了促进细胞增殖的 VEGF、Notch1 等再生因子的作用。
免疫荧光染色观察发现 3 个浓度的天然水蛭素均能促进 HMVECs 分泌 VEGF。但是仅 4 ATU/mL 浓度天然水蛭素能促进 HMVECs 分泌 Notch1，1 ATU/mL 浓度时促进作用不明显，而浓度为 7 ATU/mL 时表现为抑制作用。我们分析 VEGF 是 Notch1 的上游因子[10]，所以低浓度天然水蛭素作用时，VEGF 受体敏感性较高，开始释放 VEGF；当浓度达 4 ATU/mL 时，大量释放的 VEGF 刺激下游 Notch1 受体释放 Notch1。而浓度为 7 ATU/mL 时，天然水蛭素主要表现为抗炎作用，VEGF 受体开始关闭，虽然细胞中还残存大量 VEGF，但不能达到下游 Notch1 受体的阈值，导致下游 Notch1 受体关闭，进而 Notch1 表达水平下降。
综上述，天然水蛭素浓度为 4 ATU/mL 时，可能通过 VEGF-Notch 信号通路促进 HMVECs 增殖及血管生成；而浓度为 7 ATU/mL 时则主要通过拮抗凝血酶和抗炎改善微循环，对 HMVECs 的增殖和微血管生成起抑制作用。但天然水蛭素通过 VEGF-Notch 信号通路促进血管生成的作用机制仍不明确；VEGF-Notch 信号通路与其他细胞增殖通路的是否存在交互作用，也需进一步研究探讨。
基金资助
国家自然科学基金资助项目（81460297）