一文读懂 PCR 技术，从基础到高手进阶

一文读懂 PCR 技术，从基础到高手进阶

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**聚合酶链反应（PCR）是一种在体外快速复制DNA或RNA片段的核酸扩增技术，被誉为“分子影印术”。从1983年美国生物化学家Kary Mullis的灵感闪现，到1993年获得诺贝尔化学奖，PCR技术在短短十年间实现了从发现到应用的重大突破。本文将带你深入了解PCR技术的基础知识、实验步骤、变体类型及其广泛应用。

什么是 PCR？

PCR（聚合酶链反应）是一种核酸扩增技术，能在体外快速复制DNA或RNA片段，就像“分子影印”。1983年，美国生物化学家Kary Mullis突发灵感，后来这项技术让他在1993年获诺贝尔化学奖。

该技术基于细胞内DNA复制原理，以Sanger的DNA测序为基础发展而来。1976年发现的热稳定Taq DNA聚合酶，为PCR奠定基础。此前，因普通聚合酶无法耐受高温，每次扩增都需添加新酶。Taq酶能耐受高温，使PCR可多次循环扩增，更高效便捷。1985年，《科学》杂志首次描述PCR技术，1993年首个FDA批准的PCR试剂盒上市，此后PCR不断改进。

标准 PCR 实验概述

PCR用于从复杂起始材料中扩增特定DNA片段，部分技术无需预纯化DNA或RNA，但需知道待扩增片段两侧序列信息。

实验所需的5种关键试剂为：

• 模板DNA：来源多样，如基因组DNA、cDNA、质粒DNA等。
• DNA聚合酶：常用Taq聚合酶，适用于标准PCR。新一代聚合酶性能更优，有的可减少非特异性扩增，有的具有“校对”功能。
• 引物：是短单链DNA片段，设计时要避免与相似序列结合，保证熔融温度相似，防止形成二级结构或引物二聚体，可借助在线工具设计。
• dNTP：包含四种碱基核苷酸，等摩尔量添加用于合成新DNA链。
• PCR缓冲液：含氯化镁、tris-HCl、氯化钾，维持反应最佳条件。

将试剂混合放入热循环仪，经历变性、退火、延伸三步为一个循环，通常重复30-40次。

• 变性：95°C加热使DNA双链分离。
• 退火：冷却至50-65°C，引物与模板DNA结合，退火温度需根据引物优化。
• 延伸：升温至72°C左右，DNA聚合酶合成新链。

反应结束后，常用凝胶电泳检测扩增是否成功，根据实验目的，PCR产物可能是终点，也可能用于后续测序、克隆等研究。

PCR 变体

• 定量实时 PCR（qPCR）：可实时监测扩增并定量，借助荧光染料（如SYBR®Green）或荧光探针（如TaqMan探针），随着目标DNA增加，荧光增强，通过标准品实现定量，使用带荧光检测系统的热循环仪。
• 逆转录 PCR（RT-PCR）和逆转录定量 PCR（RT-qPCR）：用于病毒RNA分析和定量。RT是将RNA转为cDNA的过程。RT-PCR有一步法和两步法；RT-qPCR同样分一步法和两步法，先逆转录再qPCR扩增。
• 数字 PCR（dPCR）和数字液滴 PCR（ddPCR）：基于有限稀释，将反应分成众多小分区扩增，dPCR根据分区结果分析，ddPCR利用水油乳剂形成分区，2011年推出，用于新冠检测等。
• 微流控 PCR：利用微流体技术，在芯片上扩增DNA，具有速度快、试剂消耗少等优势，适用于即时检测，样品流经微通道经不同温度区完成循环。

PCR 的应用

• 研究应用：用于基因转录研究、基因分型、克隆和诱变、测序等实验，在基因工程、生物研究等方面意义重大。
• 多学科应用：在基因研究中，助力基因转录分析、生物基因序列操纵、基因分型等；医学上用于疾病诊断、产前基因检测、植入前遗传学诊断；法医学中用于亲子鉴定、法医调查、真实性测试；环境微生物学和食品安全领域用于病原体检测。

PCR技术应用广泛，改变了众多学科研究方式，是现代科学研究的重要工具。