实验干货 | 免疫荧光技术

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实验干货 | 免疫荧光技术

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https://www.do-gene.com/industry/741.html

免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）是一种在免疫学、生物化学和显微镜技术基础上发展起来的标记免疫技术。它通过将荧光色素标记到抗体或抗原上，实现对抗原或抗体的特异性检测和定位。该技术具有特异性强、敏感性高、速度快等优点，广泛应用于生物医学研究领域。本文将详细介绍免疫荧光技术的原理及其在石蜡切片和细胞爬片中的具体实验步骤。

免疫荧光技术又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。

很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体。

该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。

石蜡切片免疫荧光染色实验步骤

多聚甲醛固定组织脱水：75%酒精4h；85%酒精2h；90%酒精1.5h；95%酒精1h；无水乙醇Ⅰ0.5h；无水乙醇Ⅱ0.5h。
组织透明：组织块经酒精脱水后必须经过透明。透明剂（无水乙醇：二甲苯（1：1）溶液侵泡10min；二甲苯Ⅰ侵泡10min；二甲苯Ⅱ侵泡7min；）能同时与脱水剂和石蜡混合，它取代了脱水剂后，石蜡便能顺利地渗入组织。
浸蜡：透明后的组织块依次经3缸石蜡（60℃）进行浸蜡。石蜡Ⅰ（60℃）1h，石蜡Ⅱ（60℃）1h，石蜡Ⅲ（60℃）1h。以上3个实验步骤都在生物组织脱水机里面完成。
包埋：包埋是使浸透蜡的组织块包裹在石蜡块中。包埋用蜡的温度应略高于浸蜡温度，保证组织块与包埋石蜡完全融为一体。
切片和烤片：切片前先将蜡块切面在冻台上冷冻几分钟，然后将所要切的包埋块固定在标本夹上，使包埋块外切面与标本夹截面平行，并让包埋块稍露出一截。将刀台推至外缘后松开刀片夹的螺旋，上好刀片，使切片刀平面与组织切面间呈15°左右的夹角，包埋块上下边与刀口平行。将刀台移至近标本台处，让刀口与组织切面稍稍接触。右手转动转轮，左手持毛笔在刀口稍下端接隹切好的片子，并托住切下的蜡带，待蜡带形成一定长度后，右手停止转动，持另一枝毛笔轻轻将蜡带挑起，平放于42℃左右水浴展片锅中，用镊子将切片分开，然后用APES或多聚赖氨酸处理过的防脱玻片倾斜着插入水面去捞取切片，使切片贴附在载玻片的合适位置，于60℃烤箱烤片3个小时即可。
切片脱蜡：将石蜡切片依次放入二甲苯Ⅰ（10min）-二甲苯Ⅱ（10min）-无水乙醇Ⅰ（5min）-无水乙醇Ⅱ（5min）-95%酒精（3min）-90%酒精（3min）-80%酒精（2min）-70%酒精（2min），然后蒸馏水浸洗2min。
抗原修复：微波进行抗原修复，将脱蜡水化后的组织切片置于烧杯中的不锈钢切片架上，加适量的修复液（0.01M枸橼酸缓冲液，pH6.0）于烧杯中，液面要浸过切片组织一定高度，微波炉可先用高档加热使液体沸腾，当加热至沸腾时调到中档，此时开始计时，修复时间为10-15min。到时间后将烧杯从微波炉中取出，放入冷水中冷却降温，当修复液降至室温后取出玻片，用PBS（PH7.4）冲洗3遍，每次3min。
血清封闭：用吸水纸擦干玻片，免疫组画笔在组织周围画圈，滴加稀释好的正常山羊血清，室温封闭30min，以减少非特异性染色。
一抗染色：甩去多余液体，不洗，然后滴加稀释好的一抗，4°C湿盒中孵育过夜。
荧光二抗染色：PBST冲洗切片3次，每次3min，吸水纸擦干切片后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST冲洗切片4次，每次3min。
DAPI复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI。
用吸水纸擦干切片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。