实验技能分享：免疫荧光（步骤+常见问题）

实验技能分享：免疫荧光（步骤+常见问题）

免疫荧光（Immunofluorescence，IF）是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一种强大的技术。
它的原理是利用荧光标记的抗体作为探针对组织或细胞内的特定抗原进行定位和定性的分析。IF是一个很好的检测技术工具，用于研究感兴趣的产物如分子、蛋白质或糖蛋白的表达、定位、分布和迁移。

实验原理
细胞免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光。
利用固定剂将细胞固定，使得细胞膜的通透性大大增加，检测胞浆或者胞核蛋白时还可使用通透剂使细胞通透性进一步加强。然后利用正常羊血清或BSA等进行封闭，使许多细胞蛋白先与封闭剂非特异性结合,而特异性的目的蛋白一抗可以通过竞争性的反应与目的蛋白相结合，从而保证抗体识别的特异性。然后应用与一抗种属相匹配的荧光二抗可以特异性识别结合一抗的Fc区域，利用二抗连接的荧光基团，就可以在荧光显微镜下观察到特定颜色的荧光，从而显示目的基因的表达情况。同时，免疫荧光实验由于其较高的敏感性可以显示出基因表达的亚细胞情况(核内、核外、胞膜以及一些细胞器上)，所以通常被用来作为目的蛋白定位的方法。
实验目的
检测目的蛋白在细胞(或者组织)的表达及定位情况。
免疫荧光检测方法
1）直接免疫荧光：
携带荧光素的抗体直接与抗原反应，形成抗原—荧光素标记抗体复合物。该法优点是较简单，特异性较高；缺点是应用范围较窄，敏感性也较低。
2）间接免疫荧光：先用特异性抗体与细胞内相应抗原结合，再用荧光素标记的二抗与特异性抗体相结合，形成抗原-特异性抗体-标记荧光抗体的复合物（实验室最常用的方法）。

间接免疫荧光主要介绍
间接免疫荧光试验的主要步骤包括制备样品、固定、通透、封闭、以及一抗和二抗的孵育和最后的激光共聚焦拍照。
1. 细胞准备
将细胞接种于加有爬片的24孔板中，待细胞长到合适的密度进行样品的处理。密度太大，会造成细胞过于拥挤，形态不佳且边界不清，并且导致染色背景过深。如果细胞过少会导致细胞活性不佳，从而易发生非特异性染色，因此，染色时细胞密度最好在60%-70%左右。
2. 固定
使用4%的PFA室温固定30 min。固定液的选择取决于被研究抗原的性质及所用抗体的特性，目前4%甲醛较常用，适用于研究细胞膜蛋白。

3. 通透
固定结束后，用1×PBS洗三遍后，加入0.1% TritonX-100 100 μL/片，室温通透10 min。通透的目的是在细胞膜上打孔，让抗体进入细胞内于抗原结合。
4. 封闭
通透结束后，用1×PBS洗三遍，加入10% FBS PBS 100 μL/片进行封闭。封闭是为了放置内源性非特异性蛋白抗原结合。
5. 一抗孵育
将相应的一抗用10% FBS PBS以1：500稀释比例进行稀释，加入稀释好的一抗100 μL/片。室温孵育1 h。

6. 二抗孵育
1h结束后，用1×PBS洗三遍，将与一抗同种属的二抗用10% FBS PBS以1：500或1：1000的稀释比例进行稀释。加入稀释好的二抗100 μL/片。室温孵育1 h。
7. DAPI染核
二抗孵育结束后，用1×PBS洗三遍，加入DAPI100 μL/片，室温染核10 min。
8. 封片
封片：染核结束后用1×PBS洗三遍，然后用超纯水洗三遍，在载玻片上滴加防淬灭封片剂，将爬片弃干水后轻轻倒置放于载玻片上，室温避光干燥，-20℃保存。

9.利用蔡司LSM 800激光共聚焦显微镜拍照

注意事项：
一抗必须来源于不同种属，且荧光标记二抗、一抗的种属要匹配，二抗不能有交叉反应；从孵育二抗开始，注意避光操作，尤其是紫外光的照射，以免荧光淬灭导致假阴性结果；洗涤过程中，动作要轻柔，防止把细胞吹洗掉；选择合适的细胞密度进行试验。
10.实验结果
图片来源Ma Y-X, Chai Y-J, Han Y-Q, Zhao S-B, Yang G-Y, Wang J, Ming S-L, Chu B-B. Pseudorabies virus upregulates low-density lipoprotein receptors to facilitate viral entry. J Virol. 2023.
常见问题归纳
1.弱荧光信号

2.高背景
3.细胞/组织形态被破坏