Science | 乳腺癌可绕过血脑屏障！入侵大脑新通路
Science | 乳腺癌可绕过血脑屏障！入侵大脑新通路
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，每年有大量患者因脑膜转移而死亡。近日，杜克大学研究团队在《Science》杂志发表重要研究成果，揭示了乳腺癌细胞绕过血脑屏障、通过特定神经信号通路从骨骼转移到脑膜的新机制。这一发现为乳腺癌脑膜转移的治疗提供了新的思路。
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤。2024年4月《柳叶刀》发表的乳腺癌报告指出，2020年全球乳腺癌的发病人数高达230万，并预计到2040年全球乳腺癌新发病例将超过300万，届时每年将有100万人死于乳腺癌。
值得注意的是，在每年新发的患者病例中，约有30%的早期乳腺癌患者可发展为晚期乳腺癌，而晚期乳腺癌大多具有侵袭性强、恶性程度高、病情发展快、易发生病灶转移等特点，是乳腺癌患者死亡的主要原因。
近日，来自于杜克大学Dorothy A. Sipkins研究团队在《Science》杂志上在线发表了一篇题为Breast cancer exploits neural signaling pathways for bone-to-meninges metastasis的研究论文。
揭示了乳腺癌细胞沿着椎体血管外表面迁移，并沿着贯穿颅骨的导静脉（EV）进入软脑膜的新机制，进而为相关疾病的治疗干预提供了科学依据和潜在的新策略。
研究者基于前期研究发现，脊椎或颅盖骨髓（BM）中的白血病细胞可以通过沿着直接连接BM和LM的富含层粘连蛋白的血管外或外表面迁移而侵入LM，无需穿越血脑屏障，并且良性免疫细胞也利用这条运输通道有效地进入脑膜。
多数患有LM转移的BC患者均存在脊椎或颅盖骨转移，位于LMD显著受累部位附近，提示通过直接的BM到LM转移是有可能的，尽管在实体瘤中从未确定过这种机制。
一、BCCs 沿着连接BM和LM的静脉窦进入中枢神经系统
因此，研究者使用了一个成熟的异种移植模型和一个新的具有免疫能力的骨转移性BC 小鼠模型，来研究恶性上皮细胞是否可以利用穿过BM、硬脑膜（硬脊膜）和LM（蛛网膜和软脑膜）的静脉窦通道来定植于LM。通过组织学分析，证实了患有进行性双侧后肢瘫痪（BHLP）的小鼠存在脑和脊髓LM转移。对1833-P和EO-LM2移植小鼠的腰椎进行了放射学和组织学分析高分辨率微型CT成像显示，患有LMD的小鼠椎体静脉窦骨通道的平均直径加宽，这是BM静脉窦进入椎管和LM的孔。
紧接着，研究者在肿瘤小鼠中与BM转移相对应的脊椎水平发现了骨通道，其中包含在BM和相邻LM之间转移的血管周围乳腺癌细胞（BCCs）簇，并且BCCs与完整静脉窦骨通道内的α-SMA +血管的血管外表面结合。以上研究发现为BCC迁移到LM提供了一条独立于血液且不依赖于正常解剖屏障破坏的有效途径，而是利用了BCC的BM趋向性和连接BM与中枢神经系统的造血运输途径。
研究者进一步分析了大脑组织学切片，以寻找通过脉络丛血管系统经血液转移的BCCs 转移证据，但在任何移植后的时间点都未在脉络丛中检测到EO-LM2或1833-P BCCs。在心内移植当天（第0天），偶尔检测到BCCs在LM血管中循环，但没有在血管腔内停滞或从循环中迁移。在第3天和第23天，EO-LM2和1833-P BCCs首次出现在LM血管的血管外表面的LM中。EO-LM2和1833-P BCCs在心内移植后立即（第0天）停留在脑实质血管腔内，并在第3至14天穿过血脑屏障渗出之前一直保持在腔内。
以上研究发现表明，尽管1833-P和 EO-LM2 BCCs可以有效地从血液中定植脑实质和BM，但它们通过血管外迁移进入LM。
二、BCCs表达的整合素a6介导血管外LM侵袭
紧接着，研究者探究了层粘连蛋白受体在BC LM转移的调节作用。通过CRISPR-Cas9在1833-P和EO-LM2细胞系敲除（KO）整合素a6，发现整合素a6 KO由于作为临床终点的BHLP 发生率降低而导致生存期延长。通过对脑组织切片的分析，证实了1833-和LM2-a6 KO移植小鼠的LMD显著减少。
为了确定整合素a6是否足以使LM转移，研究者在a6阴性的MCF7人BC细胞系中过表达（OE）整合素a6。MCF7亲代（MCF7-P）细胞在心内移植后建立BM微转移，但不会转移到LM。相比之下，发现100％移植了MCF7-a6 OE细胞的小鼠在脊柱和大脑中有组织学可检测到的LMD，并且33％出现了BHLP。
与a6在LM定植中的关键作用一致，在心内移植后第3天，在LM中检测到EO-P和 EO-LM2细胞的水平相似，而仅鉴定出极少数的EO-P-a6 KO或EO-LM2-a6 KO细胞。且对移植后第3天收获的光学透明完整颅骨的成像显示，在所有EO-LM2移植的小鼠的颅骨通道内的静脉窦血管外表面都有BCC，而在EO-LM2-a6 KO移植的小鼠中未鉴定到BCC。以上研究数据表明BCC沿静脉窦血管迁移到LM高度依赖整合素a6。
三、LM中的GDNF和NCAM信号在血管周围巨噬细胞生态位中支持BCC存活
为了筛选EO-LM2细胞中可能支持其在脑膜生态位中存活或增殖的信号通路，研究者对EO-LM2与EO-P细胞进行了RNA测序（RNA-seq）分析。结果显示，神经细胞黏附分子1（NCAM1）是EO-LM2与EO-P细胞中上调最多的转录本之一，并证实了NCAM1在EO-LM2细胞表面的表达及其在EO-P细胞中的缺失。
深入的研究发现，从EO-LM2细胞中敲除NCAM1不会改变体外增殖、全身性疾病生长或LM的初始定植。1833-P 细胞中的NCAM2 KO不会改变全身性疾病负担，但增加了移植小鼠的无LMD生存期和总生存期（OS）。这些数据表明NCAMs在BCC侵入LM生态位后的存活中起作用。
随后，研究者检测了GDNF是否能保护NCAM + 1833-P和EO-LM2细胞免受营养缺乏诱导的细胞死亡。在营养缺乏的条件下，重组GDNF处理显著保护细胞免于死亡，并且这种效果被NCAM受体和GFRa1共受体阻断所逆转。免疫组织化学（IHC）证实EO-LM2和1833 患病小鼠的LM基质内GDNF沉积显著增加，且CD206+巨噬细胞而非tdT+肿瘤细胞是 GDNF的来源。
进一步分析显示，边缘相关巨噬细胞（BAMs），包括硬膜下、硬脑膜MHCIIlow 和硬脑膜 MHCIIhigh BAMs 以及单核细胞衍生的巨噬细胞（MDMs）是GDNF 的主要来源，而其他脑膜细胞群体。
此外，三维（3D）重建显示BCCs紧密地嵌在血管和血管周围巨噬细胞之间，表明它们被CSF1R+细胞保护性包裹。PLX5622治疗通过IVM测量不影响BCC对LM的定植；然而，LM 内 BCCs 的生长显著减少，相应地，治疗小鼠临床LMD进展（BHLP）的时间延长。并且抗GDNF抗体治疗的小鼠在LMD症状发展时间上显著减少，具有显著的生存益处。
因此，以上研究数据表明驻留的髓样细胞通过支持LM生态位内BCC的存活和增殖来促进LMD。巨噬细胞衍生的GDNF是BC LMD进展的关键因素。
四、整合素a6和GDNF表达与BC患者的脑膜转移相关
接下来，研究者探究了整合素a6受体表达是否与诊断为BC的患者的脑膜转移相关。分析发现，整合素a6阳性与脑膜病变之间存在统计学显著的相关性。尽管在少数样本中检测到 NCAM1（7个中有3个），但所有基于脑膜的活检都显示出NCAM2 在BC中的广泛表达。
最后，研究者对基于脑膜转移活检标本组中可用病例进行GDNF和CD68表达的IHC染色，发现6个样本中有5个显示GDNF阳性，其特征是肿瘤周围基质的强烈染色。与健康对照样本相比，疾病样本显示出显著更高的GDNF阳性和CD68染色，表明在恶性肿瘤期间GDNF分泌以及单核细胞和巨噬细胞的丰度增加。进一步通过机器学习和病理定量分析，肿瘤样本中的CD68+细胞多数是GDNF+，并且GDNF+区域内的大多数细胞是CD68 +。这些数据表明巨噬细胞是患者中GDNF沉积的重要来源。
综上，本文研究成果揭示了BCCs 能够利用造血细胞运输通道进入柔脑膜，证实了整合素a6和NCAM在此过程中起到重要作用。同时表明了BCCs选择内在的神经元-基质串扰在LM中存活生长。