国标脂肪酶活力测定方法详解

国标脂肪酶活力测定方法详解

脂肪酶活力测定是生物化学和酶学研究中的一个重要环节，广泛应用于食品、医药、化工等多个领域。本文将详细介绍国标脂肪酶活力测定方法，包括原理、定义、溶液配制及具体操作步骤，为相关领域的研究和应用提供参考。

脂肪酶活力测定的原理

脂肪酶隶属于羧基酯水解酶类，在一定的温度、pH值范围内，能够逐步地将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。所释放的脂肪酸可用标准碱溶液进行中和滴定，用pH计或酚酞指示液指示反应终点。根据消耗的碱液量计算其酶活力，反应式为RCOOH+NaOH →RCOONa+H2O。

酶活定义

在40℃温度和pH7.5条件下，1g固体酶粉或1mL液体酶，1min水解底物产生1umol的可滴定的脂肪酸，即为1个酶活力单位，以u/g(u/ml)表示。

脂肪酶制剂的酶活力，按以下公式计算：

X1 = (V1-V2 )c50n1/0.051/15

式中：

• X1：样品的酶活力，u/g
• V1：滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液的体积,单位为毫升（ml）
• V2：滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液的体积,单位为毫升（ml）
• c：氢氧化钠标准溶液浓度，单位为摩尔每升（mol/L）
• 50：0.05mol/L氢氧化钠溶液1.00ml相当于脂肪酸50umol
• n1：样品的稀释倍数
• 0.05：氢氧化钠标准溶液浓度换算系数
• 1/15：反应时间15min,以1min计

所得结果表示至整数。

溶液和试剂

1. 聚乙烯醇（PVA）：聚合度1750±50
2. 橄榄油：试验试剂
3. 95%（体积分数）乙醇
4. 底物溶液：称取聚乙烯醇（PVA）40g（精确至0.1g），加水800ml，在沸水浴中加热，搅拌，直至全部溶解，冷却后定容至1000ml用干净的双层纱布过滤，取滤液备用；取上述滤液150ml,加橄榄油50ml，用高速匀浆机处理6min（分两次处理，间隔5min，每次处理3min），即得乳白色PVA乳化液。该溶液现用现配。
5. 磷酸缓冲溶液（pH=7.5）：分别称取磷酸二氢钠1.96g和十二水磷酸氢二钠39.62g，用水溶解并定容到500ml。如需要，调节溶液的pH到7.5±0.05
6. 氢氧化钠标准溶液[c(NaOH)=0.05mol/l]：按QB/T 601配置与标定。使用时，准确稀释10倍
7. 酚酞指示液（10g/l）；按QB/T603配制

操作方法

一、电位滴定法

1. 按pH计使用说明书进行仪器校正
2. 取两个100ml烧杯，于空白杯（A）和样品杯（B）中各加入底物溶液4.00ml和磷酸缓冲液5.00ml，再于A杯中加入95%乙醇15.00ml,与40℃±0.2℃水浴中预热5min，然后于A、B杯中各加待测酶液1.00ml,立即混匀计时，准确反应15min后，于B杯中立即补加95%乙醇15.00ml终止反应取出
3. 在烧杯中加入一枚转子，置于电磁搅拌器上，边搅拌，边用氢氧化钠标准溶液滴定，直至pH10.3为滴定终点，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积

二、指示剂滴定法

1. 取两个100ml三角瓶，分别于空白瓶（A）和样品瓶（B）中各加入底物溶液4.00ml和磷酸缓冲液5.00ml,再于A瓶中加入95%乙醇15.00ml，于40℃±0.2℃水浴中预热5min，然后于A、B瓶中各加待测酶液1.00ml，立即混匀计时，于40℃±0.2℃水浴中准确反应15min，于B瓶中立即补加95%乙醇15.0ml终止反应，取出
2. 于空白和样品溶液中各加酚酞指示液2滴，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定，直至微红色并保持30s不褪色为滴定终点，记录消耗0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的体积