免疫组织化学染色技术及应用探索
免疫组织化学染色技术及应用探索
免疫组织化学染色（Immunohistochemistry，IHC）是一种将免疫学与组织化学相结合的技术，通过抗原-抗体特异性结合的原理，对组织或细胞中的特定抗原进行定位、定性和定量分析。这项技术在医学研究、病理诊断和药物研发等领域具有广泛的应用。本文将从抗体选择、孵育过程、二抗作用、抗原修复、组织切片烤片、DAB使用、非特异性染色问题的应对以及切片洗涤等多个方面，详细介绍免疫组织化学染色的关键技术和操作要点。
免疫组织化学染色
免疫组化技术是当代医学研究领域的一项关键技术，其基石在于抗原与抗体之间的特异性结合以及随后的显色过程。这项技术包含了一系列精细的步骤，虽然初学者能够较快掌握其基本操作，但要想达到精通并获取高质量的染色结果，却并非易事。
如何精选抗体以确保最优染色成效？
抗体主要分为两大类：多克隆抗体与单克隆抗体，它们均通过与抗原上的特定区域——抗原决定簇进行识别而发挥作用。
诚然，单克隆抗体因其卓越的特异性而备受推崇，能够精确无误地标记目标蛋白。然而，在实际操作中，若组织固定或抗原修复环节处理不当，可能会破坏与单克隆抗体特异性结合的抗原决定簇，进而引发假阴性结果。此外，单克隆抗体对实验条件，如反应体系的环境和pH值等，有着较为严格的要求，因此不能一味地依赖或迷信单克隆抗体。
相比之下，多克隆抗体能够识别更多的抗原决定簇，展现出更广泛的识别能力。在某些特定情境下，当单克隆抗体无法有效识别抗原时，多克隆抗体或许能够力挽狂澜，发挥意想不到的作用。当然，多克隆抗体的特异性相对较弱，这是其不足之处。
如何有效掌控染色中的抗体孵育过程？
抗体孵育是染色步骤中的关键环节，其中孵育时间与抗体的浓度密切相关，通常呈反比关系。在进行免疫组化染色时，确保孵育时间的恒定至关重要，因为任何时间上的波动都可能显著影响整体染色效果和染色强度。特别地，随着孵育温度的升高，这种差异会变得更加明显。
目前，许多抗体供应商提供的抗体均支持在4℃条件下过夜孵育或在37℃恒温条件下进行孵育。这两种孵育方式均可行，但关键在于，对于同一项研究而言，为确保实验的一致性和可比性，所有指标应采用相同的孵育温度和时间，这一点至关重要。
二抗于免疫组化染色中的关键作用是什么？
在免疫组化染色流程中，二抗扮演着不可或缺的桥梁角色，对于确保染色结果的稳定性和可靠性具有重大意义。值得注意的是，市场上不同厂商生产的二抗，其效价存在着显著的差异，这种差异已通过统计学研究得到证实，具有明确的科学意义。鉴于免疫组化实验本身包含多个复杂步骤，其重复性相对有限，因此，选择高质量、高效价的二抗显得尤为重要，以尽可能提升实验的准确性和一致性。
如何精准控制抗原修复过程？
抗原修复的质量是免疫组化染色成功与否的关键所在。抗原修复方法多样，如微波炉法（操作简便但染色强度较弱，存在假阴性风险）、高压锅法（染色效果显著但可能导致切片脱落）、水浴法（使用频率较低，步骤繁琐）等。尽管目前尚未有统一理论全面阐释抗原修复机制，但有一种解释较为直观易懂：甲醛固定会导致抗原间发生交联，而修复过程则能解开这些交联，使抗原结合位点得以暴露。然而，甲醛固定所引发的变化及抗原本身的复杂性远超此解释。
在进行抗原修复时，需关注两大要点：一是确保修复液加热至95℃-100℃，并维持此温度约15-20分钟；二是让切片在修复液中自然冷却至室温，避免使用冷水急剧降温，且修复液不宜回收使用。
以下介绍两种修复方法：
常规高压修复法
切片经脱蜡入水后，用去离子水漂洗3次，每次2分钟；随后置于高压锅中修复10分钟；修复完成后再次用去离子水漂洗3次，每次2分钟；最后用PBS漂洗3次，每次2分钟，即可继续后续的免疫组化步骤。
组合修复法
切片脱蜡入水后，用去离子水漂洗3次，每次2分钟；接着用3%过氧化氢孵育约5分钟；再次用去离子水漂洗3次，每次2分钟；随后将切片置于0.01%枸橼酸钠溶液（PH6.0）中，使用微波炉加热至98℃，进行微波热修复15-20分钟，以增强胞膜和核膜的通透性；待其自然冷却至室温后，用PBS漂洗3次，每次2分钟；接着用1%胰酶（PH9.0）在室温下孵育15分钟，以消除甲醛固定对抗原的负面影响；最后用PBS漂洗3次，每次2分钟，即可继续后续的免疫组化步骤。
组织切片烤片应持续多长时间为宜？
当采用阳离子防脱玻片进行制片后，将切片置于55-60℃的温度下烤片1小时，能够有效确保抗原活性的良好保持。若使用常规玻片，则可能存在脱片的风险，因此更推荐使用阳离子防脱玻片。据病理技术专家的测试结果显示，若烤片温度过高（超过60℃）或烤片时间过长（如过夜烤片超过16小时），均可能在一定程度上削弱抗原的免疫活性。因此，合理控制烤片时间和温度对于保持抗原活性至关重要。
DAB使用的关键注意事项有哪些？
尽管有些人可能忽视了DAB的重要性，但实际上，DAB在免疫组化过程中扮演着至关重要的角色，直接影响最终的染色结果。对于有过免疫组化操作经验的人来说，都深知DAB显色时间的长短对染色强度有着显著的影响。
目前，大多数实验室都会采用即用型DAB试剂，这种试剂通常由DAB浓缩液和DAB稀释液按一定比例配制而成，且需要现配现用。其中，DAB浓缩液一般由DAB粉末和Tris缓冲液精心配制，为了保持其稳定性，建议将其存放在-20℃的冰箱中，并确保避光保存。而DAB稀释液，其主要成分为0.3%的过氧化氢，由于该成分见光易分解，因此同样建议避光并在4℃条件下保存。综上所述，正确使用和储存DAB试剂，对于确保免疫组化实验的准确性和可靠性至关重要。
如何应对免疫组化中的非特异性染色问题？
在免疫组化实验中，非特异性染色是一个常见且棘手的问题，它可能对我们的分析结果产生显著影响，尤其是在目的蛋白染色较浅时更为突出。在排除了切片过厚、染色过程中切片干燥、DAB过度显色或洗涤步骤不充分等常见原因后，我们可以尝试以下策略来解决非特异性染色问题。
对于进行肝、肾或肿瘤研究的科研人员来说，内源性生物素可能是一个重要的干扰因素。为了减轻其影响，可以尝试延长内源性过氧化物酶的孵育时间和血清封闭时间，这在一定程度上有助于减少非特异性染色。如果问题依然存在，我们可以从两个方面进行排查。首先，可以尝试用PBS替代二抗或三抗进行染色，以排除二抗或三抗导致的非特异性染色。其次，可以尝试更换抗原修复方法，因为抗体说明书中的建议仅供参考，在必要时我们可以灵活变通，比如将原本使用的PH6.0修复液更换为PH值更高的修复液。
此外，对于存放时间较长的蜡块或切片，它们更容易出现非特异性染色。在这种情况下，使用PH6.0修复液可能比使用PH9.0修复液更为有效。
切片洗涤有哪些实用技巧？
切片洗涤是免疫组化实验中一个耗时较多的环节。需要注意的是，我们通常所说的“漂洗切片”并非指直接用水流冲洗切片，因为这样做很可能导致切片脱落。正确的做法是将切片浸泡在PBS溶液中。为了更有效地进行洗涤并缩短时间，如果条件允许，可以考虑引入微量振动台，将切片置于台上进行漂洗，这样可以显著提高洗涤效率。若不具备这样的条件，也可以尝试使用ELISA平板振动台或常规的平板摇床来辅助切片洗涤。
请介绍一种高效的冰冻切片修复改良方法？
在常规修复方法之外，这里分享一种从专业书籍中获得的改良冰冻切片修复技术。首先，按照标准流程制作冰冻切片；随后，将切片进行漂洗，并在室温下用过氧化氢避光孵育大约10分钟；接着，用去离子水对切片进行3次漂洗，每次持续2分钟；之后，使用PH值为6.0的修复液，通过微波法进行3次重复的修复处理；接下来，用BSA对切片进行20分钟的封闭；然后，将切片与一抗孵育30分钟；再与二抗孵育20分钟；最后进行显色反应。这种改良方法不仅能够显著提升染色效果，还能有效缩短整个染色流程的时间。