Cell最新综述：CRISPR的前世今生
Cell最新综述：CRISPR的前世今生
CRISPR/Cas9技术自被发现的十年来屡屡获奖，已成为当前炙手可热的基因编辑工具，为基础生物学和疾病治疗带来了重大变革。特别是从2023年底到2024年初，全球首款基于CRISPR的基因编辑疗法CASGEVY™相继在英国、美国、沙特及欧盟等4个国家的获批，标志着CRISPR真正走出了实验室。
近期，瑞士苏黎世大学的科学家在Cell发表了一篇题为“Past, present, and future of CRISPR genome editing technologies”的综述论文，强调了过去CRISPR技术的发展和应用，并讨论重要的技术进展以及未来的前景。
CRISPR的“前世今生”：过去、现在
1987年，一篇论文首次将CRISPR带入人类的视野。研究人员偶然发现在细菌基因组中存在含有29个碱基的高度同源序列重复性，且这些重复序列被含32个碱基的序列间隔开。2002年，这种重复序列被正式命名为CRISPR，即一种成簇规律间隔的短回文序列，并且在重复序列附近发现了一系列保守的CRISPR相关基因。直到2012年，Emmanuelle Charpentier和Jennifer Doudna等发现了CRISPR/Cas9的详细作用机制。
图1. CRISPR的10年来发展之路
之后发展的十来年里，CRISPR/Cas9也获得前所未有的殊荣：
2013年12月，Science认定CRISPR基因编辑技术获得十大科学突破；
2015年12月，Nature将其评为“十大科学事件之一”；
2020年10月，发现CRISPR/Cas9基因编辑技术的两名科学家Emmanuelle Charpentier和Jennifer Doudna荣获诺贝尔化学奖；
2023年11月16日，首个CRISPR基因疗法CASGEVY™在英国首次获批上市用于治疗镰刀状细胞贫血病（SCD）和输血依赖性β-地中海贫血（TDT）；
2023年12月8日，又在美国FDA获批上市用于治疗SCD；
2024年1月9日，再次获得沙特阿拉伯批准上市用于治疗SCD和TDT；
2024年1月16日，再获美国FDA批准用于治疗TDT；
2024年2月13日，进一步获得欧盟（EMA）批准上市用于治疗SCD和TDT。
回顾CASGEVY™在短时间内的接连获批之路，无疑是制药史上基于CRISPR技术领域的重要里程碑事件，也会进一步促进监管机构对于基因编辑疗法的授权，凸显出了CRISPR发展的巨大潜力。
CRISPR技术的进化之路
CRISPR/Cas9被认为是继ZFN、TALEN之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。
1.CRISPR/Cas9：
由两部分组成，分别是Cas9 蛋白和guide RNA（sgRNA）。Cas9蛋白具有解旋酶活性，可以将DNA链解旋，同时具有核酸内切酶活性，可以切割DNA链。CRISPR/Cas9系统仍然存在着一定的局限性，这种局限性主要体现在功能发挥时系统对DNA上PAM序列的依赖性以及切割时潜在的脱靶效应等。因此科学家们在CRISPR/Cas9的基础上开发了更加高效且广谱的精准基因编辑工具——单碱基编辑技术BE（Base Editor）和精准基因编辑工具PE（Prime Editors）及发掘出新型的Cas酶，如Cas12、Cas13等。
图2. CRISPR系统主要技术分类
2.单碱基编辑技术BE（Base Editor）：
是一种基于脱氨酶与CRISPR/Cas9系统融合形成的技术。2016年，由哈佛大学David Liu实验室首次报道，主要包括CBE和ABE单碱基编辑工具。相比于CRISPR/Cas9技术，BE技术可以既不引入DNA双链断裂，又不需要重组修复模板，整体提高了编辑的安全性和精准性，而且其效率远远高于由发生DSB引起的HDR和NHEJ修复方式，对于许多点突变造成的遗传疾病具有很大的应用潜能。
3.精准基因编辑工具PE（Prime Editors）：
2019年10月21日，由哈佛大学David Liu实验室开发，PE是以CRISPR/Cas9系统为基础，在pegRNA（prime editing guide RNA）和融合蛋白（将nCas9（H840A）与M-MLV逆转录酶融合）两方面加以优化。PE的优势在于可以在不依赖DSB的前提下，能够实现更精准的编辑，更广的试用范围。
4.转录调节技术CRISPRi 和 CRISPRa：
目的是对基因表达进行瞬时操作，通过靶向失活的Cas9（dCas9）与转录调节结构域（如 VP64 或 KRAB）融合到基因启动子实现RNA引导的基因转录控制。
5.RNA编辑酶：
目前发现的主要是可以靶向RNA的Cas13核酸酶，用于靶向转录本降解（当具有催化活性时）或用于转录本编辑（当催化失活并融合到腺苷脱氨酶时）。
6.Cas9外的Cas酶家族：
其他除了上述几种基因编辑工具以外，科学家们还发现了除Cas9外的Cas家族的其它一系列蛋白，如 Cas12a、Cas12i、CasX等。
CRISPR应用潜力巨大
1.为基础研究提供丰富的模型
在基础研究领域，利用CRISPR技术可以更快更准确的构建各种细胞和动物模型，如基因敲除/敲入等不同疾病的动物模型用于疾病机理研究及药物评价等。
2.更快的诊断和药物发现
未来CRISPR将和AI结合，可以进行高通量的自动化筛选致病基因。
3.将为更多疾病提供彻底治愈的方法
基因治疗包括体内和体外治疗2种方式，不仅仅是局限于罕见病，虽然现在CRISPR已在罕见病上大展身手，但是随着技术不断发展，比如发现更多类型的Cas蛋白、优化的BE及PE技术等，将会为更多疾病提供治疗手段。
图3. CRISPR的主要应用方向
最后，作者也对CRISPR未来的新型技术发展方向做了展望，如提到RNA指导的核酸酶、DNA聚合酶编辑器、CRISPR指导的重组酶和转座子、逆转录的碱基编辑、RNA编辑及新兴递送系统等等将会在未来有新的突破并大展身手。
在过去十年中，科学家们致力于建立各种CRISPR平台，但这仅仅是一个开始。在未来的十年里，我们将看到这些平台对现实世界产生的影响，如首个CRISPR疗法已获批上市，随着越来越多的相关临床试验将展开，未来会有更多基因疗法获批为人类造福。
参考资料：
[1] Pacesa M, Pelea O, Jinek M. Past, present, and future of CRISPR genome editing technologies. Cell. 2024 Feb 29;187(5):1076-1100. doi: 10.1016/j.cell.2024.01.042. PMID: 38428389.