实验干货分享 | 一文教会你抗原修复的方法

实验干货分享 | 一文教会你抗原修复的方法

引用

丁香园

1.

https://3g.dxy.cn/bbs/topic/51181333

在免疫组化实验中，抗原修复是一个关键步骤，它能有效解决甲醛固定导致的抗原掩蔽问题。本文将详细介绍两种常用的抗原修复方法：热诱导抗原修复法和酶促抗原修复法，帮助实验人员掌握正确的操作流程和注意事项。

在免疫组化的石蜡包埋法制片过程中，甲醛固定处理会导致相邻蛋白质间形成亚甲基桥结构，这种结构会阻止抗体与抗原表位的特异性结合，产生抗原掩蔽效应，导致某些抗原染色效果不佳甚至无法染色。为了逆转这种效应，需要进行抗原修复处理。

热诱导抗原修复法

实验原理

热诱导抗原修复法通过在一定温度的抗原修复液中对组织切片进行适当时间的加热处理，使蛋白质处于水相环境中，加热加速蛋白水解过程，从而打开因固定交联而形成的化学连接，暴露原先被遮蔽的抗原决定簇。

操作步骤（以微波法为例）

1. 脱蜡与再水化处理：将石蜡切片分别放入三种不同梯度浓度的二甲苯溶液中，每次3分钟；再分别放入不同梯度浓度的工业酒精或甲醇中，每次3分钟；最后用自来水冲洗。
2. 热修复处理：将冲洗后的玻片放入装有柠檬酸三钠缓冲液（pH=6）或EDTA缓冲液（pH=9）的容器中，然后放入微波加热设备中加热直至缓冲液沸腾，并持续15分钟。
3. 冷却：将容器从微波加热设备中取出，并将冷水倒入容器中继续冷却10分钟。
4. 染色处理：冷却后取出玻片进行染色处理。

注意事项

• 热诱导抗原修复法对大部分抗原有效，但高温可能导致某些抗原结构改变。
• 取出切片时，组织切片几乎立即干燥，这种快速干燥过程可能会导致抗原特性的丧失，因此需等到抗原修复液自然冷却后再取出。
• 过度修复可能导致组织切片分离以及假阴、假阳和非特异性染色概率的增加。

酶促抗原修复法

实验原理

酶促抗原修复法利用特定浓度的蛋白质水解酶在适当的pH和温度下对组织切片进行孵育，通过蛋白质的水解作用使被掩蔽的抗原表位暴露出来。

操作步骤

1. 水浴加热：设置水浴温度为37℃，待其温度升至设定温度。
2. 脱蜡与再水化处理：将石蜡切片分别放入三种不同梯度浓度的二甲苯溶液中，每次3分钟；再分别放入不同梯度浓度的工业酒精或甲醇中，每次3分钟；最后用自来水冲洗。
3. 加热玻片：将玻片置于水浴槽中加热。
4. 制备酶缓冲液：在另一个水浴槽中加入少量氯化钙和胰蛋白酶（或其他蛋白水解酶），使其达到适当浓度，并用氢氧化钠和盐酸溶液调节pH至最佳值，然后加热至37℃。
5. 酶促修复：将加热后的玻片放入37℃的酶缓冲液中孵育一段时间（如20分钟）。
6. 冷却与染色处理：将玻片在自来水下冷却后进行染色处理。

注意事项

• 酶促抗原修复法的操作步骤相对复杂，且易受温度和pH等条件影响。
• 酶的选择和浓度、孵育时间等因素需根据具体抗原进行优化。

总结

目前，热诱导抗原修复法因其较好的批间一致性和适用性更广泛，已在一定程度上取代了酶促抗原修复法。然而，对于某些特定抗原或实验条件，酶促抗原修复法可能仍具有优势。为了选择最合适的抗原修复液、pH和修复方法，需要对每种抗原进行深入研究。在实际操作中，应严格控制修复条件，以确保抗原修复的成功和实验结果的准确性。

本文原文来自丁香园