ELISA试剂盒底物的显色原理

ELISA试剂盒底物的显色原理

ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种广泛应用于医学诊断、生物研究和药物开发领域的检测技术。其核心原理是通过酶催化反应产生的颜色变化，实现对目标分子的定性或定量检测。本文将详细介绍ELISA试剂盒底物的显色原理，帮助读者深入了解这一重要技术。

ELISA（酶联免疫吸附测定）的底物显色原理基于酶催化反应产生的颜色变化，通过这一变化实现对目标分子的定性或定量检测。以下是其核心原理的详细说明：

基本流程

• 抗原-抗体结合：目标抗原被固定在固相载体（如微孔板）上，与特异性抗体结合。
• 酶标记抗体：通过直接或间接法（如二抗）引入酶标记的抗体（常用酶包括辣根过氧化物酶HRP、碱性磷酸酶AP等）。
• 底物反应：加入无色底物，酶催化底物分解，生成有色产物。

显色反应的关键步骤

酶的选择与对应底物

• HRP（辣根过氧化物酶）：

• 底物：TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）、OPD（邻苯二胺）、ABTS（2,2'-联氮双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）。

• 反应原理：在过氧化氢（H₂O₂）存在下，HRP催化底物氧化。

• 例如：TMB被氧化后生成蓝色产物（最大吸收波长450 nm），加入硫酸终止反应后变为黄色（吸收波长450 nm）。

• 特点：灵敏度高、反应快速，需酸性终止液。

• AP（碱性磷酸酶）：

• 底物：pNPP（对硝基苯磷酸酯）、BCIP/NBT（5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐/氮蓝四唑）。

• 反应原理：AP催化底物水解。

• pNPP水解生成黄色的对硝基苯酚（吸收波长405 nm）。

• BCIP/NBT生成蓝色/紫色沉淀（适用于肉眼观察或比色法）。

• 特点：反应较温和，无需终止液，适合长时间孵育。

颜色变化的定量分析

• 显色产物的吸光度（OD值）与目标分子浓度呈正相关，通过酶标仪测量特定波长下的吸光度值，绘制标准曲线即可实现定量分析。

其他类型底物

除了显色底物，ELISA还可使用以下底物系统：

• 荧光底物：酶催化底物生成荧光物质（如HRP催化Ampliflu Red），通过荧光酶标仪检测。
• 化学发光底物：酶催化底物产生光信号（如HRP催化鲁米诺），通过化学发光仪检测，灵敏度更高。

关键影响因素

• 酶活性：温度、pH、抑制剂可能影响酶反应效率。
• 底物稳定性：需避光保存（如TMB见光易分解）。
• 反应时间：显色时间过长可能导致背景信号升高。

应用场景

• 显色底物（如TMB、pNPP）适用于常规ELISA检测。
• 化学发光/荧光底物适用于高灵敏度检测（如低丰度蛋白、细胞因子）。

通过这一原理，ELISA实现了对蛋白质、抗体、病毒等生物分子的高特异性检测，广泛应用于医学诊断、生物研究和药物开发领域。