标记免疫技术——免疫荧光技术

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免疫荧光（Immunofluorescence，IF）是一种广泛用于生物医学和细胞生物学研究的光学成像样品前处理技术，能够在细胞或组织切片中通过荧光标记的抗体检测并定位特定的蛋白质。这项技术结合了抗原-抗体的特异性识别和荧光分子标记，使研究人员可以通过荧光显微镜观察目标蛋白在细胞或组织中的分布和定位。

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基本原理

根据抗原、抗体的反应原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检测细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察样本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光，由此可以观察荧光所在的细胞或组织，从而对抗原或抗体进行定性、定位，以及利用定量技术进行定量。

实验步骤

1. 细胞准备 (Cell Preparation)

• 贴壁细胞：细胞传代时，将细胞接种在预先放置有处理过的盖玻片或玻片的培养皿中，培养至50-70%融合度，确保细胞状态良好，并紧贴盖玻片表面后，取出盖玻片，PBS洗两次
• 悬浮细胞：取对数生长细胞，用PBS离心（1000rpm, 5min）洗涤2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片
• 组织切片：建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片。制备好的组织切片，放置于玻片上

2. 固定 (Fixation)

• 加入4% PFA固定液，室温固定10-20min。PFA能使细胞内蛋白质交联，从而固定其位置不易降解。固定结束后，立即用PBS洗涤3×5 min，彻底去除残留的固定液

3. 透化 (Permeabilization）

• 用0.1%-0.5% TritonX-100溶液透化细胞，室温孵育10min， TritonX-100会溶解细胞膜，使抗体可以渗透到细胞内部。透化后，用PBS洗涤3×5 min

4. 封闭（Blocking）

• 加入5%-10%的正常山羊血清，或1%-5%的BSA（牛血清白蛋白）溶液，室温孵育30-60min，无需洗涤

5. 一抗孵育（Primary Antibody Incubation）

• 根据抗体说明书，按适当浓度（如1:100-1:500）稀释一抗，使用封闭液（如含BSA的PBS）作为稀释剂，向细胞或组织样本中加入稀释好的一抗溶液，4℃过夜孵育（或室温孵育1-2h）。注意避光操作，避免荧光猝灭。孵育结束后，用PBS洗涤3×5 min，以去除未结合的抗体

6. 二抗孵育 (Secondary Antibody Incubation)

• 稀释荧光标记的二抗，按说明书推荐浓度（如1:500-1:1000）稀释二抗，注意避光，加入稀释好的二抗溶液，室温避光孵育1h。孵育后，用PBS洗涤3×5 min，去除未结合的二抗

7. 核染色 (Counterstaining, Optional）

• 在最后一次PBS洗涤中加入DAPI或Hoechst核染色剂，按1μg/ml的浓度进行染色，室温孵育5-10min，避光操作。用PBS再次洗涤3×5 min

8. 封片 (Mounting)

• 在盖玻片上滴加适量荧光猝灭封片剂（如ProLong Gold Anti-fade Mountant），小心覆盖盖玻片，避免形成气泡，封片后，样本可以在避光低温条件下保存，建议尽快进行显微镜观察

9. 荧光显微镜观察 (Imaging）

• 在荧光显微镜下使用相应的激发光和滤光片，观察标记的荧光信号
• 如果使用了多重染色，确保根据不同的荧光染料（如Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 594）选择适合的滤光片，依次观察不同颜色的荧光信号，拍摄图片，保存数据

常见问题

1. 背景颜色深

• 一抗浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，即使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。
• 一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要么不显色要么背景着色。用新买抗体时更好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。
• 抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，可以随身佩戴计时器，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1h，而是30min，因此，要根据染色结果进行调整。
• DAB变质和显色时间太长：DAB更好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB的显色更好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。
• 组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAPPen在组织周围画圈，可以有效避免液体流失，也能提高操作速度。
• 切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24h）：原因上不清楚，但现象存在。有的实验室喜欢前将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在4C冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。

2. 染不上

• 多聚甲醛固定时间过长或者不够：调整固定时间。
• Triton透化：Triton透化程度不够，或者Triton透化过度。
• BSA孵育。
• 一抗(确定抗体量是足够的)：使用量不够或者稀释比例过大，重新调整后再重染。
• 二抗(确定抗体量是足够的)：和一抗一样重新稀释或者加大使用量重新染色。
• 看荧光；荧光强度有可能不足，可以重新选择标记物重新标记，进行分析。

3. 定位不对

• 细胞核干扰：细胞核位置前面的细胞质染色干扰造成，可以降低抗体浓度，孵育时间。
• 细胞或者组织状态不对：细胞或者组织状态不同导致你的目的蛋白细胞定位不同，造成最后的定位不对，如果一直出现定位不对问题，建议重新培养细胞调整好状态或者重新取材，进行再次染色。
• 共定位问题解析：假设想证明某一细胞发生某种变化，换句话说就是既有某种蛋白表达，又有另一种蛋白表达，两种蛋白属于共定位，该种情况可以采用免疫双标记检测；如果两种蛋白不属于共定位，假设一种在膜上表达，一种在胞浆表达，该种情况应该不属于共定位，属于共表达，这时候实验应该重新设计去验证你的结论。
• 核定位不对：核内表达的抗原定位用免疫荧光或者免疫酶标都可以。如果定位不正确，建议封闭和打孔合为一步，即在封闭液中添加0.5% TritonX-100，37℃封闭2h，加一抗后最好4度孵育过夜16h。