DNA疫苗：历史、分子机制及未来前景
DNA疫苗：历史、分子机制及未来前景
DNA疫苗作为一种新型疫苗技术，自20世纪60年代被发现以来，经历了从基础研究到临床试验的快速发展。虽然在人类应用中遇到了一些挑战，但其独特的分子机制和潜在优势使其在未来的疫苗研发中仍具有重要地位。本文将为您详细介绍DNA疫苗的历史、分子机制、免疫原性挑战及未来前景。
一、DNA疫苗的历史
早期基础研究
1960年，Ito等人首次证明纯化的DNA具有在体内转染哺乳动物细胞并表达编码蛋白的能力。他们发现注射肿瘤来源的乳头瘤病毒DNA片段可在兔子体内诱导肿瘤产生。1980年代，研究者在其他动物模型中也证明了DNA质粒注射的效果，如注射乙肝病毒DNA质粒可在黑猩猩中诱导典型急性肝炎。1990年，有研究证明肌肉注射编码报告基因的DNA质粒可转染小鼠肌肉细胞并表达报告分子。
免疫反应发现及动物模型验证
1992年，研究者首次描述DNA疫苗可引发免疫反应。他们发现，在小鼠中引入人生长激素（hGH）和人α-抗胰蛋白酶（hAAT）基因可引发相应抗体产生。Wang等人描述注射编码HIV-1 gp160的DNA质粒并添加佐剂可诱导保护性免疫反应。此外，在慢性乙肝病毒感染的鸭模型中也证明了对已建立的慢性感染的影响。这些发现表明，在体内注射后表达转基因的细胞数量足以刺激保护性免疫反应，并使得这项新技术迅速向临床试验过渡。
图1 DNA疫苗发现、人体临床试验和许可疫苗的时间轴
临床试验进展
1998年开展的首个人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）感染的DNA疫苗I期临床试验，结果显示疫苗接种后有特定免疫反应，但无法得出疫苗有效性的结论；同年另一份报告显示健康志愿者接种编码疟疾蛋白的质粒DNA后产生了特定CD8+T细胞反应。这些试验表明DNA疫苗是安全且耐受性良好的，因此使用DNA疫苗针对传染病、过敏、自身免疫和癌症进行了数百项临床前和临床试验。研究表明DNA疫苗能够在人类中诱导免疫反应，突出了DNA疫苗在应对许多人类疾病方面的光明前景。
二、DNA疫苗的分子机制
DNA疫苗的一般作用机制是在宿主内递送一个或多个感兴趣的基因，旨在体内表达抗原，成功表达的抗原可能会触发疫苗接种者的免疫反应。DNA疫苗的作用机制可分为摄取、抗原产生和加工、抗原呈递三个主要阶段。
质粒摄取机制
目前有三种主要的质粒摄取机制：①、通过细胞膜孔扩散：DNA质粒可通过细胞膜上的孔进入宿主细胞，这些临时孔可能自然产生于细胞膜上，允许 DNA 通过自然扩散进入细胞。②、通过胞饮作用摄取DNA质粒包括受体介导的内吞作用和小窝蛋白介导的内吞作用。受体介导的内吞作用是细胞主动摄取细胞外物质的机制，利用细胞膜受体将蛋白质包被的囊泡引入细胞内空间。小窝蛋白介导的内吞作用是细胞外分子在细胞膜内陷处被内化的过程。③、细胞膜直接破坏促进摄取：细胞膜的暂时破坏可促进DNA疫苗载体的内化。这种因细胞膜主动破坏而增强的DNA质粒摄取已被观察到可在多种组织中显著增加DNA表达。
抗原产生和加工
抗原由宿主细胞自身的蛋白质表达机制产生。DNA可在细胞质中自由移动或在细胞质囊泡内移动，并通过核孔进入细胞核。在细胞核内质粒作为模板进行转录、翻译，最终表达编码的抗原。表达的抗原在宿主细胞内经历所有翻译后修饰，根据表达抗原的性质，特别是信号序列的使用，可以作为可溶性蛋白分泌到细胞外，触发细胞内炎症途径或呈递在主要组织相容性复合体（MHC）上。因此DNA疫苗编码的产品可以触发先天免疫和适应性免疫系统的激活。
抗原呈递途径
MHC-I呈递内源性抗原：直接转染抗原呈递细胞（APCs）导致内源性表达的抗原加工，抗原在APCs内源性表达，在细胞质中分解为较小的肽段，然后加载到细胞内质网的MHC-I分子上，此途径是激活具有细胞毒性活性的CD8+T细胞的关键来源。MHC-II呈递内源性抗原：内源性抗原也可在细胞内体中被蛋白酶降解，然后由MHC-II分子呈递。MHC-II呈递外源性抗原：转染体细胞可能导致抗原作为可溶性蛋白分泌到细胞外，或在细胞死亡时释放。这些外源性抗原通过吞噬溶酶体被内化后，被蛋白酶破坏并加载到吞噬体区室的MHC-II分子上，然后转移到细胞表面。MHC-I交叉呈递外源性抗原：外源性抗原在细胞质中、低pH内体中或通过吞噬溶酶体相关蛋白酶的作用被降解后，在吞噬溶酶体与内质网融合后，降解抗原的多肽可呈递在MHC-I分子上。
三、克服免疫原性挑战的策略
使用佐剂
用于DNA疫苗的两种主要佐剂类型：被称为传统佐剂的化学化合物，以及遗传或分子佐剂。传统佐剂如铝盐和油包水乳液在小鼠模型中有一定效果，但在大动物物种和人类中效果不佳。由于化学佐剂与DNA疫苗作用的时间不相容，遗传佐剂被广泛研究。遗传佐剂可在同一位置和时间框架内同时表达抗原和免疫调节剂，从而促进它们的相互作用。
使用替代递送系统
在为提高DNA疫苗的免疫原性而探索的多种策略中，包括使用先导序列改变、RNA和密码子优化、改进插入设计、提高DNA浓度以增加抗原表达等，最受期待的是通过物理方法改进DNA递送。选择递送系统可以极大地影响免疫反应水平以及达到期望免疫反应水平所需的免疫剂量和免疫次数。最有前景的物理方法包括电穿孔、基因枪、微针阵列和喷射注射。
四、DNA疫苗的安全性
任何疫苗的一个重要特征就是其安全性。DNA疫苗被认为比减毒活疫苗更安全，因为不存在恢复为强毒菌株的风险，因此可以用于免疫功能低下的患者。最初主要的安全担忧是与遗传相关的影响，比如长期存在并整合到宿主基因组中的可能性。另一方面也存在与免疫相关的影响，包括诱导自身免疫和免疫病理反应。
基因整合风险
DNA疫苗需要进入细胞核才能发挥作用，因此给接种者施用DNA疫苗会使他们接触到可能插入基因组的外源DNA，外源基因插入宿主基因组可能导致插入突变，并可能激活癌基因或使抑癌基因失活。然而多项安全研究未记录到质粒整合的实验证据，鉴于游离质粒在宿主细胞中可稳定存在数月，DNA疫苗长时间的抗原表达是否会导致耐受性需要持续监测和进一步研究。食品药品监督管理局（FDA）为此设计了相关指南，确保质粒整合频率低于自发突变率，并规定对于新型质粒或配方和递送方法。
免疫相关影响
细菌DNA可引发抗DNA IgG自身抗体，导致小鼠自身免疫。原核疫苗载体可能包含未甲基化的CpG序列，可被免疫系统识别为病原体相关分子模式（PAMPs），导致辅助T细胞1型（Th1）偏向的免疫反应，但临床前测试和临床监测未发现DNA疫苗诱导自身免疫的证据。
五、DNA疫苗的优势及展望
优势
DNA疫苗的主要优势包括免疫反应激活全面、免疫刺激特性、抗原特异性、应用灵活性及易于操作生产等。DNA疫苗可同时激活体液和细胞免疫反应；具有内在的免疫刺激特性，通过识别CpG基序和双链DNA，激活先天免疫反应，可被TLR9和胞质DNA受体检测到；作为核酸疫苗只编码和表达目标病原体的特定抗原，免疫反应可聚焦于感兴趣的抗原；可用于多次免疫，或作为异源初免-加强免疫方案的初免。还可共递送抗原基因，有些能通过表达细胞因子等改变免疫反应，或设计表达异种抗原或非自身抗原以增加免疫原性和克服免疫耐受。此外DNA质粒易于操作，DNA疫苗可被涉及和重新设计，编码新兴病原体变体的序列或突变以及高度可变的肿瘤抗原。同时DNA疫苗具有高度的热稳定性，不需要特定的冷藏温度，并且在最终制剂中易于储存。
未来展望
通过优化设计和递送方法，可能克服免疫原性和安全性挑战，实现更广泛的应用。如果优化成功，可能会因过度刺激免疫系统而引发非特异性炎症反应，需要在临床前和临床研究中仔细评估。其递送方法通常需要设备，这些设备在从非临床到临床应用的转化上可能存在困难，在不同地区的产品管理规定也不同，可能需要作为组合产品或单独产品进行开发，增加了产品开发的难度。尽管在人类应用中没有病毒载体和mRNA成功，但DNA疫苗仍是一种有潜力的技术。
结语
DNA疫苗具有高效、安全、低成本且易于大规模生产等优点，特别是在预防和治疗传染病方面展现出巨大的潜力。2020年全球对可扩展且稳定的SARS-CoV-2疫苗的需求加速了DNA疫苗的批准。随着技术的不断进步和应用的扩大，DNA疫苗有望在未来的公共卫生领域发挥更加重要的作用。