苹果酸补料策略提高枯草芽孢杆菌DF生长和产孢效率
苹果酸补料策略提高枯草芽孢杆菌DF生长和产孢效率
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）在生长代谢过程中能产生丰富的淀粉酶、蛋白酶等酶类，分泌活性物质抑制致病菌生长、调节肠道菌群、增强机体免疫力，具有安全性能高、抗逆性强的特点，广泛应用于微生态制品和食品领域。枯草芽孢杆菌的高密度发酵是微生态制品生产的关键环节。
湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室的丁跃、陈琛、王志*等在30 L发酵罐水平研究耦合pH 8.0流加苹果酸对枯草芽孢杆菌DF生长和芽孢生成的调控作用，旨在使苹果酸增强糖异生和TCA循环等的运转效率、缓解氧化胁迫、提高芽孢组分的表达水平，促进细胞生长和芽孢生成效率，为枯草芽孢杆菌高密度、高芽孢率发酵提供理论和技术支撑。
30 L发酵罐水平枯草芽孢杆菌DF的发酵生长特征
如图1所示，pH值在发酵8 h降至最低值5.32（数据未显示），后持续回升至16 h的8.0。22 h的pH值回升至8.79并维持至发酵结束。13～24 h 菌体生长进入对数期，生物量由13 h的5.47×109 CFU/mL对数生长至24 h达到峰值（2.14×1010 CFU/mL）；同时芽孢数由13 h的2.77×109 CFU/mL提高至24 h的1.89×1010 CFU/mL，并在24 h达到最大芽孢率88.3%，发酵基本实现高密度水平。24～27 h，生物量及芽孢数分别由各自峰值快速下降至8.61×109、6.20×109 CFU/mL，分别下降了59.7%、67.2%。说明24 h后存在细胞生长或芽孢形成的限制因素。乙酸质量浓度由13 h的0.96 g/L持续降至24 h的最低值（0.43 g/L），说明发酵13 h时，葡萄糖代谢引起的“碳溢流”已停滞，乙酸作为储备碳源被细胞吸收，并经氧化呼吸代谢二次利用，这与马文龙的报道一致。另外，13～16 h比生长速率（μ）为0.30 h－1，16～24 h的μ为0.06 h－1，比前者下降了80.0%，说明乙酸16 h降至0.61 g/L时，已不足以维持细胞保持高生长速率（μ＝0.30 h－1）。
耦合pH 8.0流加苹果酸对菌株DF生长和芽孢形成的影响
考察耦合pH 8.0补料苹果酸 （16～27 h）对枯草芽孢杆菌DF生长的影响,如图2所示，pH值变化趋势与对照基本一致，16 h回升至8.0（数据未显示），耦合pH 8.0苹果酸补料（16～27 h）过程维持在8.0左右。13～24 h菌体处于对数生长期，生物量在13 h达到5.81×109 CFU/mL，与对照（图1）持平；22 h达到峰值3.68×1010 CFU/mL，较对照（24 h，2.14×1010 CFU/mL，图1）提高了71.9%。芽孢数在13 h达到2.61×109 CFU/mL（与对照接近）。而22 h芽孢数达到3.63×1010 CFU/mL，较对照（22 h，1.89×1010 CFU/mL，图1）提高了92.1%，芽孢率为98.6%，较对照（图1，芽孢率88.3%）提高了10.3%；而且19～22 h芽孢率维持在98%以上，芽孢率显著提升。说明耦合pH 8.0流加苹果酸能有效促进菌株DF生长和芽孢形成。
16～27 h开始流加苹果酸（16～22 h补加390 mL、22～24 h补加90 mL、24～27 h补加120 mL）。13～16 h乙酸质量浓度由1.08 g/L降低至0.71 g/L，其变化趋势与对照一致。16～22、22～24 h和24～27 h苹果酸流加速率分别为65、45 mL/h和40 mL/h（数据未显示），乙酸积累至19 h的峰值（2.77 g/L），质量浓度提高到16 h的3.90 倍，并于3 h后（22 h）降至最低值0.41 g/L。16～22 h细胞生长速率几乎未受影响，其μ为0.18 h －1 ，比对照16～24 h的μ（0.06 h －1 ）提高2 倍。说明苹果酸引起了“碳溢流”使乙酸合成效率增强，并作为储备碳源支撑了16 h后细胞的生长（图2）。
考虑到苹果酸具有抗氧化作用，其显著促进了芽孢杆菌DF的生长（图2），研究其是否会对其氧化应激过程产生影响，测定了发酵过程 过H2O2的浓度，如图3所示，对照发酵的H2O2浓度由16 h的1 534 μmol/L快速积累，24 h达峰值（1 890 μmol/L），26 h降至1 091 μmol/L。而苹果酸补料使H2O2浓度由16 h的1 477 μmol/L，下降至19 h的919 μmol/L，下降了37.78%，且在19～24 h维持稳定，后下降至26 h的756 μmol/L。结果说明，耦合pH 8.0补加苹果酸可有效降低发酵过程H2O2浓度，16 h开始流加苹果酸后，H2O2浓度较对照（发酵19～24 h）下降45.9%～51.3%，有效降低了H2O2的生成。
苹果酸对糖异生、磷酸戊糖途径代谢的影响
苹果酸经TCA循环代谢可对草酰乙酸进行回补，进而增强糖异生途径、TCA循环和NADH供应。因而对糖异生和磷酸戊糖途径关键基因的表达差异进行了分析，如图4所示，苹果酸补料发酵的ccpN表达下调了33.5%、pckA上调了38.0%、fbaA（编码1,6-二磷酸果糖醛缩酶）上调了1.51 倍，说明草酰乙酸向磷酸烯醇式丙酮酸的转化效率提高，糖异生途径加强。同时，zwf（编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）表达量提高了1.23 倍。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶等催化葡萄糖-6-磷酸生成5-磷酸核酮糖和NADPH生成。而NADPH是ROS清除酶系最终的电子供体，因而苹果酸可通过糖异生及磷酸戊糖途径代谢产生大量NADPH，加强了菌体氧化应激的适应性，从而提高生长效率。这与发酵过程细胞生长和芽孢生成效率显著提高（图2）的现象一致。
苹果酸对TCA循环、溢流代谢的影响
苹果酸补料对菌株DF的TCA循环、溢流代谢基因表达的影响如图5所示。citZ（编码柠檬酸合酶）表达上调了2.10 倍，ppaC（编码锰依赖型焦磷酸酶）催化ADP的合成，其表达水平上调了1.46 倍，说明TCA循环碳流量通路增加，电子传递链末端磷酸化底物（ADP）供应加强，促进了能量代谢。
此外，22 h的poxL（编码丙酮酸氧化酶）下调了72.9%，说明经由丙酮酸氧化酶生成H2O2的效率下降，降低了H2O2积累，这与发酵过程H2O2浓度显著下降（图3）的现象一致。而yflL（编码酰基磷酸酶）下调了68.8%，这与22 h乙酸处于被二次利用的现象一致（图2）。同时，acuB（编码乙偶姻利用蛋白）转录水平上调了3.53 倍，也证实了溢流分子总体处于被二次利用的状态。
值得注意的是，催化乙酰CoA生成乙醛的谷胱甘肽依赖型醛脱氢酶adhB上调了3.79 倍，减少了乙酰CoA的竞争消耗、间接促进了TCA循环对乙酰CoA的供应，同时降低了乙醛积累对菌体生长的毒性，并缓解了其对生长的抑制作用。
苹果酸对氧化应激系统的影响
苹果酸使得发酵中后期H2O2浓度下降45.9%～51.3%，（图3），因而分析了ROS清除系统关键酶的表达差异，如图6所示，sodF（编码超氧化物歧化酶）清除超氧阴离子，其表达量上调了3.08 倍，降低了超氧阴离子的积累。PerR是氧化应激阻遏蛋白，perR表达下调，缓解了对超氧化物歧化酶的阻遏、促进了超氧阴离子的清除。
过氧化物酶PRDX在清除H 2 O 2 的过程中需要硫氧还原蛋白还原酶TRXR（由trxA编码）的动态还原以恢复活性，trxA上调了2.88 倍（P＜0.001）。同时，H2O2酶katE表达量较对照下调了74.5%。说明H2O2的清除主要由PRDX-TRXR系统完成。苹果酸使PRDX-TRXR组成的H2O2清除系统效率更高，有效降低了H2O2的生成效率、缓解了胁迫强度（图3），进而促进了细胞生长（图2），这也与苹果酸补料使发酵过程H2O2浓度显著下降（图3）的结果一致。
苹果酸对芽孢生成效率的影响
苹果酸对菌株DF芽孢生成相关基因表达的影响如图7所示，kipL（激酶KinA的抑制剂）下调了75.9%、clpX上调了2.67 倍（ClpX与Sda结合，解除Sda对KinB激酶的抑制作用）；phrC、phrF高效表达（分别上调了12.76、9.09 倍）使得rapA、rapD（Spo0F去磷酸化）分别下调了58.2%、57.5%，共同增强了KinA和KinB参与的磷酸传递效率（Spo0F是磷酸根受体）。另外，磷酸传递系统的spo0B（编码Spo0B）表达量上调了73.0%，也有利于磷酸基团向Spo0A的传递。
菌体快速生长时，转录调控因子AbrB阻遏sigH的表达，使Spo0A的磷酸化处于较低水平。相反Spo0A的磷酸化增强，可抑制abrB的表达，使sigA（编码SigA，能与RNA核心酶结合）脱阻遏，促进spo0A基因表达。苹果酸补料时，abrB表达下调了65.9%、sigA表达上调了2.45 倍，间接提高了Spo0A的磷酸化水平。
结果说明，苹果酸增强了菌株DF芽孢程序启动的效率，促进了Spo0A～P的生成和积累。这与苹果酸促进菌体芽孢生成效率的结果（图2）一致。
结 论
高芽孢率是枯草芽孢杆菌应用于食品发酵工业和微生态领域的基础条件，耦合pH 8.0流加苹果酸补料增强了芽孢杆菌DF细胞sodF、trxA等抗氧化酶基因的表达强度，降低了发酵过程H2O2浓度，缓解了细胞氧化损伤。同时，通过强化糖异生途径和TCA循环促进了NADH、NADPH的合成，提高了能量供应效率，使菌株DF生物量达到3.7×1010 CFU/mL，较对照（未补苹果酸）提高71.9%；芽孢数达到3.6×1010 CFU/mL，较对照提高92.1%，显著提高了生长和芽孢生成效率。研究结果可为枯草芽孢杆菌高密度、高芽孢率发酵提供理论和技术支撑。
本文《苹果酸补料策略提高枯草芽孢杆菌DF生长和产孢效率》2024年45卷第2期172-177页，作者：丁 跃，陈 琛，鲁佳康，陈 雄，黄亚男，王 志。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230424-231。