PCR技术操作流程详解

PCR技术操作流程详解

聚合酶链式反应（PCR）是一种广泛应用于分子生物学、医学诊断等领域的关键技术，它能够在体外快速扩增特定的DNA片段。本文将详细介绍PCR技术的基本原理和具体操作流程，帮助读者深入了解这一重要技术。

PCR的基本原理

PCR技术的基本原理类似于DNA在体内的复制过程。具体步骤如下：

1. 变性：将待扩增的DNA模板加热至95℃左右，使双链DNA解旋成单链。
2. 退火：将反应体系冷却至某一温度（通常为55-65℃），使设计好的引物与模板DNA的互补序列结合。
3. 延伸：将温度升高至72℃左右，此时Taq DNA聚合酶开始从引物的3'端延伸新的DNA链。

这个变性-退火-延伸的过程称为一个PCR循环。通过不断重复这个循环过程，目标DNA片段的数量呈指数级增长。

PCR反应体系

PCR反应体系主要包括以下几部分：

1. 缓冲液
   标准的缓冲液含1pmol/ml Tris·HCl，其pH为8.3-9.0（室温），而在延伸温度（72℃）下，pH值接近7.2。缓冲液中含有一种二价阳离子，用于激活DNA聚合酶的活性中心，一般使用Mg2+。

2. dNTP
   脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）是合成新的DNA链的材料，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP等。4种dNTP的浓度相等，总浓度一般为200pmol/ml（即饱和浓度）。dNTP可与Mg2+结合，影响DNA聚合酶的活性。

3. 引物
   引物是一段短的单链DNA片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点。引物长度一般以18～30bp为宜，过短则降低特异性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。

4. 模板
   模板是一段单链或者双链DNA，提供用于进行PCR扩增的原始信息。对模板的纯度要求低，但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白等。模板DNA应该尽量保持低温保存。

5. Taq DNA聚合酶
   Taq DNA聚合酶以DNA为复制模板，从将DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTP等的情况下）及其相辅的活性。必须一直保存于－20℃，内含甘油保存。最适反应温度72℃，即延伸温度。通常在配制PCR体系的最后加入。