植物转录组分析流程总结

植物转录组分析流程总结

引用

CSDN

1.

https://m.blog.csdn.net/henlenya/article/details/141159775

植物转录组分析是研究植物基因表达和调控的重要工具。本文将详细介绍植物转录组分析的完整流程，从样品准备到数据分析，帮助读者快速掌握这一技术的核心要点。

以下是一个详细的植物转录组分析流程，涵盖了从样品准备到数据分析的各个步骤。

1. 样品准备

1.1 样品采集

• 选择适当的组织或器官（如叶片、根、花等）。
• 确保样品的新鲜度，快速液氮冷冻保存，或者使用RNA稳定剂。

1.2 RNA提取

• 使用RNA提取试剂盒或传统方法（如Trizol法）提取总RNA。
• 测定RNA浓度和纯度（使用NanoDrop、Qubit等），确保A260/A280比值在1.8-2.1之间。
• 评估RNA完整性（使用Agilent 2100 Bioanalyzer或RNA胶电泳）。

2. RNA测序文库构建

2.1 mRNA富集或rRNA去除

• 对mRNA进行富集（通常使用polyA富集）或去除rRNA（适用于非编码RNA研究或总RNA测序）。

2.2 cDNA合成

• 使用反转录酶将富集后的mRNA逆转录为cDNA。
• 进行第二链合成得到双链cDNA。

2.3 文库构建

• 将双链cDNA进行末端修复，加A尾，连接接头。
• 选择合适的片段长度进行PCR扩增。
• 进行文库质控，确保片段大小和浓度适合测序要求。

3. 高通量测序

• 选择适当的测序平台（如Illumina、PacBio或Oxford Nanopore），根据项目需求选择单端或双端测序。
• 设置测序深度，通常转录组分析需要30-100百万读长（reads）。

4. 数据处理

4.1 质量控制

• 使用FastQC检查原始测序数据的质量。
• 使用Trimmomatic或Fastp进行质量剪切，去除低质量读段和接头序列。

4.2 比对到参考基因组

• 使用比对软件（如HISAT2、STAR或Bowtie2）将清洗后的reads比对到参考基因组。
• 计算比对率，评估比对效果。

4.3 转录本组装（可选）

• 如果没有高质量参考基因组，使用de novo组装工具（如Trinity）进行转录本组装。

4.4 基因表达定量

• 使用featureCounts或HTSeq对基因进行定量，得到每个基因的读段计数（read count）。
• 或者使用RSEM、Salmon或Kallisto等工具直接计算基因表达量（FPKM、TPM等）。

5. 数据分析

5.1 差异表达分析

• 使用DESeq2、EdgeR或Limma等工具进行差异表达基因分析。
• 设定显著性阈值（如P值<0.05，log2 fold change>1）。

5.2 功能注释与通路分析

• 使用GO和KEGG数据库对差异表达基因进行功能注释和通路富集分析。
• 可使用ClusterProfiler、g:Profiler等R包进行富集分析。

5.3 共表达网络分析（可选）

• 使用WGCNA构建基因共表达网络，识别功能模块。
• 分析重要模块与表型的关联。

5.4 可视化

• 使用热图（heatmap）、火山图（volcano plot）、主成分分析（PCA）等方法对结果进行可视化。
• 使用R或Python绘制表达模式图、网络图等。

6. 结果验证（可选）

• 通过qRT-PCR或其他实验手段验证关键差异表达基因。

7. 报告与解读

• 整理分析结果，生成报告。
• 结合文献和实验设计，解读转录组分析的生物学意义。

这个流程可以根据具体的研究目标和实验条件进行调整，但涵盖了植物转录组分析的主要步骤。