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质粒是独立于宿主DNA复制的环状DNA。它们天然存在于E.Coli等细菌中，并为宿主提供竞争优势，包括抗生素抗性以及在极端环境中生存的能力。质粒已成为重组DNA技术的基本工具。鉴于它们比宿主染色体更小、数量更多，它们可以很容易地以纯化形式分离。此外，它们稳定且易于操纵，可用目的治疗性基因替换非必需遗传物质。在治疗水平上，质粒DNA正被积极用于DNA疫苗和基因疗法，以对抗各种感染性、后天性和遗传性疾病。此外，质粒DNA也被用作病毒载体疫苗、mRNA疫苗和病毒载体基因疗法的关键起始材料。
一、质粒介绍
质粒是具备自主复制能力的小型闭合环状双链DNA分子，能够表达所携带的遗传信息。其存在于原核生物、真菌和少数植物细胞中，是一种核外遗传物质，但不是细胞生存所必需的。质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状态，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。质粒DNA大部分都是双链超螺旋的闭合环状，少数是线性化的，且具有可转移性、可整合性，以及拷贝数，后者分为松弛型和严紧型两种状态。
质粒DNA主要有3种基本构型：超螺旋（Covalently Closed Circular, CCC），线性（Linear）和开环（Opened Circular, OC）构型。在此基本构型基础上，各自又有多种聚合形态（图1）。因此在细胞基因治疗产品、mRNA药物开发制造过程中，需要结合质粒DNA分子特点和法规定位，开发针对性的工艺，并制定相应的质量控制标准。在基因治疗和DNA疫苗的研究中，药用质粒的超螺旋含量为FDA>80%，NMPA≥90%。目前，关于超螺旋质粒，线性质粒以及开环质粒的分离和检测方法已较为成熟，包括琼脂糖凝胶电泳、高效液相色谱和毛细管电泳等[1]。
图1 不同的质粒DNA 构型
二、质粒的里程碑式发展
质粒对生物学的贡献及其对生物技术和发现的影响是巨大的。1990 年，Wolff及其同事将含有氯霉素乙酰转移酶、荧光素酶和 β-半乳糖苷酶基因的质粒的盐水溶液注射到活小鼠的骨骼肌中，从而引发了质粒生物制药的发展（图 2）。作者发现，在这种“裸”质粒DNA分子中编码的报告基因转基因后在肌肉细胞内表达。自此，质粒迎来了10年重大创新式的发展。如用1991年通过电击完成了在体内递送质粒，实现细胞因子与靶基因的共表达，向质粒骨架中添加免疫刺激CpG，利用纳米颗粒递送质粒，以及通过快速全身注射大体积溶液给药质粒DNA等。这些早期的里程碑式进展，为质粒药物的开发积累了宝贵的经验，使得其在临床的使用成为可能[2]。
图2 质粒发展的重要里程碑
三、质粒的组成
基于质粒的基因治疗和DNA疫苗接种，均依赖于转基因向靶细胞的有效递送和表达。典型的质粒载体主要以紧密扭曲的超螺旋拓扑异构体形式存在（图 3）。对于一个质粒，最简单的形式应该包括一个复制起始位点，一个抗性基因，至少一个酶切位点。这些元件可以保证质粒在细菌内的扩增，同时允许携带质粒的细菌从不含质粒的细菌中进行分离。另外，限制酶切位点允许能够将DNA片段插入到质粒中。而详细的组成原件及其功能为，原核复制起点直接与质粒拷贝数、产量相关，抗性基因（如Amp、Kan等）可以赋予宿主细胞抗生素抗性，多克隆位点则包含多个酶切位点、可用于分子克隆，启动子则可启动目的基因转录，目的基因筛选标记是用于导入目的基因后的评价和筛选，而目的基因则为mRNA和AAV的模板、基因治疗中的拟插入的基因、CAR-T中的目的基因等。质粒载体的设计应考虑诸如体内质粒的稳定性、转基因表达的特征、原核序列的影响以及宿主免疫系统对载体的反应等方面。
图3 质粒的理化特性与组成原件
四、质粒的生产与纯化
质粒的工艺开发是一项必须与产品开发同时进行的工作，工艺流程如图4所示。首先是含有目标质粒的细胞库制备以及原材料的选择和测试，紧接着为选择设计合适的细胞培养和下游处理单元操作。关于细胞培养，质粒是通过促进大肠杆菌中的复制而产生的。需要选择菌株（例如，DH5a，JM109）或开发菌株（例如，GALG20）。一旦选择了菌株并用目标质粒进行转化，就必须仔细选择和分离高产克隆，完成携带质粒细胞的主细胞库和工作细胞库的建立。并选择生长培养基组成、生物反应器操作变量和培养策略，以最大限度地提高质粒产量。
Tips：通过优化基础培养基、补料培养基和发酵控制策略，建立了适用于质粒生产的大肠杆菌高密度发酵平台工艺，培养周期30h内，质粒产量超过1g/L。
此外，能够针对不同的质粒和宿主菌，基于单因素或DoE方法提供工艺优化解决方案，定制化满足质粒高产量、高质量需求。
下游纯化的目的旨在回收质粒DNA并去除宿主杂质（基因组DNA、RNA、蛋白质等），直到达到药用水平。纯化大致可分为三个阶段：初级分离、中间纯化和最终纯化。在第一阶段，收获细胞（例如，通过微滤）和裂解（例如，碱性裂解、热裂解）以释放质粒DNA。在随后的中间纯化阶段，通过使用切向流过滤、沉淀、吸附和水性两相系统等操作处理澄清裂解物，以减少杂质负荷并浓缩质粒。最终纯化旨在去除更顽固的杂质，如gDNA和pDNA变体。传统的色谱模式，如凝胶过滤、阴离子交换和疏水相互作用都已用于纯化质粒。下游处理过程的最后一步通常是使用0.22μm过滤器进行无菌过滤[3,4]。
图4 质粒的经典生产工艺流程图
五、质粒的应用及市场前景
质粒拥有广泛的市场前景和应用方向（图5）。质粒DNA载体是目前细胞基因治疗常用载体之一。质粒DNA可作为起始原材料或起始关键物料，包装制备病毒载体，如慢病毒载体、腺相关病毒载体等；也可用于体外转录mRNA；质粒DNA还可作为药物活性成分，直接治疗患者。根据Research and Markets测算，2028年，全球载体病毒和质粒DNA的总市场规模将由2020年22亿美元上涨至86亿美元。而根据Coherent Market Insights公司的总结，质粒DNA的占比将达到25%的份额。此外， QYResearch医疗健康研究中心报告指出，仅2020年质粒DNA在中国的总销量已经达到4千万人民币左右。加之随着mRNA的异常火爆，质粒也变得水涨船高，受到医药行业的更多追崇。表1中，梳理了不同应用场景下，质粒的需求量和质量要求[5]。
表1 不同应用场景下质粒的需求量和质量要求
结语
过去30年的经验，已经证实利用质粒介导的基因治疗已经慢慢成为人类疾病群的可选解决方案。但目前质粒药物仍正处于较为早期的阶段，没有在临床得到广泛的批准使用。虽然质粒的临床适用也存在一定风险，如质粒和衍生片段整合到宿主基因组DNA中，抗DNA抗体和自身免疫反应对机体的刺激。但到目前为止的临床和动物实验数据表明，质粒总体上具有良好的耐受性和安全性。
参考文献
[1] Schleef M, Blaesen M, Schmeer M, Baier R, Marie C, Dickson G, Scherman D. Production of non viral DNA vectors. Curr Gene Ther. 2010 Dec;10(6):487-507.
[2] Prazeres DMF, Monteiro GA. Plasmid Biopharmaceuticals. Microbiol Spectr. 2014 Dec;2(6).
[3] Stadler J, Lemmens R, Nyhammar T. Plasmid DNA purification. J Gene Med. 2004 Feb;6 Suppl 1:S54-66.
[4] Schmeer M, Schleef M. Production of Plasmid DNA as Pharmaceutical. Methods Mol Biol. 2015;1317:315-26.
[5] Guan X, Pei Y, Song J. DNA-Based Nonviral Gene Therapy─Challenging but Promising. Mol Pharm. 2024 Feb 5;21(2):427-453.