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CCK-8法检测细胞增殖/细胞毒性:实验步骤详解

创作时间:
作者:
@小白创作中心

CCK-8法检测细胞增殖/细胞毒性:实验步骤详解

引用
丁香园
1.
https://3g.dxy.cn/bbs/topic/51287447

CCK-8法(Cell Counting Kit-8)是一种广泛应用于细胞增殖和细胞毒性检测的实验方法。该方法通过检测细胞线粒体中脱氢酶的活性来反映细胞的增殖情况,具有操作简便、灵敏度高、重复性好等特点。本文将详细介绍CCK-8法检测细胞增殖和细胞毒性的实验步骤及注意事项。

一、细胞增殖实验步骤

  1. 细胞培养:在96孔板中设置空白组、对照组和实验组,每个样本做三个重复组。空白组不加细胞,加入同体积的培养基,以排除培养基的颜色干扰;对照组加入含血清培养基,不加药物或其他处理;实验组经过药物或者其他因素处理。每孔加入100μL细胞悬液,并在37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养细胞。贴壁细胞的最小接种细胞量为1000个/孔,若为白细胞,接种量不低于2500个/孔。细胞量取决于实验需要培养时间和细胞生长速度。例如,细胞需要培养72h,并且长得快,每孔需要减少细胞量。若铺的细胞过少,CCK-8显色时间较久,若想缩短时间,可以通过增加细胞量实现。

  2. 细胞贴壁:将培养板放入37°C、5% CO2的细胞培养箱中培养,使细胞贴壁,培养时间根据细胞类型而定。

  3. 药物处理:向每孔加入10μL不同浓度的药物中加入不同浓度的药物或其他处理,继续培养至所需时间。

  4. 加入CCK-8:悬浮细胞向每孔中加入10μL的CCK-8溶液,由于加入的CCK-8量比较少,可能会因试剂沾在孔壁上而带来误差,(一般把枪头直接插入96孔板的培养液中,全部打进去不松手,枪头从液面下拿出后,再松手)在加完试剂后轻轻晃动培养板以帮助混匀,或者直接配置含10%CCK-8的培养基,以换液的形式加入贴壁细胞中。另外注意,加样的过程中尽量不要产生气泡,会影响吸光度。

  5. 继续孵育:将96孔板在37°C,含5%CO2的细胞培养箱中孵育适当时间,当吸光度在1.0左右比较好,肉眼可见液体变成橙色。如果暂时不测定OD值,可向每孔中加入10 μL 0.1 M HCl溶液或者1%(W/V)SDS溶液,并遮盖培养板避光室温保存。在24小时内吸光度不会发生变化。(一般立刻去测OD值,此方法是网上的,我们未用过)

  6. 检测吸光度:尽快通过酶标仪在450nm波长处检测各孔吸光度(OD值),吸光度的高低反映了细胞的增殖情况。

细胞增殖活力(%)=(OD 处理组 - OD 空白组)/(OD 对照组 - OD 空白组)×100%

  1. 评估细胞增殖和活力:根据吸光度的变化,可以评估细胞的增殖情况和活力。细胞增殖越多越快,颜色越深;细胞毒性越大,则颜色越浅,对于同样的细胞,颜色的深浅与活细胞的数量成正比,所以如果显色不够的话,可以延长培养时间。看到颜色变成橙色,太浅的话继续孵育,显色时间与细胞量也有关系,细胞多即显色时间短。

二、细胞毒性分析

实验步骤与细胞增殖实验相似,仅是加入的处理组不同,对细胞的作用不同。

  1. 制备细胞悬液并计数:每孔加入100μL细胞悬液,分为空白组、对照组和实验组,每个样本做三个重复组。

  2. 培养细胞贴壁:需要大约2-4h,如果是悬浮细胞,不需要贴壁,直接进行下一步。

  3. 加入毒性物质:向培养板各孔中加入不同浓度的毒性物质(药物、化学试剂等待检测物质)。

  4. 孵育:将培养板放入培养箱中孵育一段时间,例如6、12、24、48h,具体时间要看待测物质的性质和细胞的敏感性。如果待检测物质有氧化性或还原性,可在加入CCK-8之前更换新鲜培养基,以去掉待测物质的影响。如果影响比较小或者没有影响,可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

  5. 加入CCK-8:向每孔中加入10μl CCK-8溶液,加样的过程中尽量不要产生气泡。

  6. 继续孵育:通过酶标仪在450nm波长处检测各孔吸光度(OD值)

细胞毒性活力(%)=(OD 处理组 - OD 空白组)/(OD 对照组 - OD 空白组)×100%

三、注意事项

  1. 在正式实验前,需要进行预实验,用不同浓度细胞量铺板,找到合适的细胞铺板量,CCK-8孵育时间也需要摸索,对照组吸光度接近1.0为最佳孵育时间。

  2. 操作过程中应避免气泡产生,以免影响OD值的测定 。

  3. 培养板最外一圈的孔容易干燥,通常不作为测定孔使用,每孔加入200 ul 1×PBS以避免边缘效应。

  4. 铺板时一定要将细胞充分混匀,尽量保证每个孔的细胞数量一致,减少误差,在每次加样前再次混匀细胞。

  5. 由于培养基颜色、药物干扰,必须设计空白组,对照组。空白组不加细胞,加入同体积的培养基,用来排除培养基的颜色干扰,对照组加入含血清培养基,不加药物或其他处理,实验组经过药物或者其他因素处理。

本文原文来自丁香园

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