酵母双杂交技术：原理、实验流程及应用

酵母双杂交技术：原理、实验流程及应用

酵母双杂交技术是一种用于检测蛋白质相互作用的实验方法，通过构建融合蛋白并观察其在酵母细胞中的相互作用来判断蛋白质之间的相互作用关系。该技术具有高灵敏度、无需纯化蛋白等优点，但也有假阳性较多等局限性。本文将详细介绍酵母双杂交技术的原理、实验流程及应用。

背景说明

酵母双杂交技术最早由Fields在1989年发明，基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究。GAL4包括两个结构域：DNA结合结构域（BD）和转录激活结构域（AD）。BD能够识别并结合位于GAL4效应基因上游的激活序列（UAS），而AD则可以启动下游基因的转录。只有当BD和AD在空间上充分接近时，才能呈现完整的GAL4转录因子活性。

在酵母双杂交系统中，BD与X蛋白融合，AD与Y蛋白融合。如果X、Y之间形成蛋白-蛋白复合物，AD与BD会在空间上充分接近，重新构成结构域，启动报告基因的转录。酵母双杂交系统由三个部分组成：与BD融合的蛋白表达载体（诱饵蛋白）、与AD融合的蛋白表达载体（靶蛋白）以及带有报告基因的宿主菌株。

服务流程

酵母双杂交实验主要包括以下几个步骤：

1. 载体构建
2. 诱饵自激活验证
3. 互作验证
4. 实验报告

适用场景

酵母双杂交技术适用于以下场景：

1. 高灵敏度地检测蛋白-蛋白的交互作用
2. 寻找在蛋白-蛋白交互作用中起关键作用的结构域或活性位点
3. 寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白
4. 寻找具有药物治疗作用的小分子多肽
5. 寻找调控蛋白质相互作用的化合物
6. 绘制蛋白质相互作用图谱

实验流程

1. 酵母菌株活化

从YPDA平板上挑取生长2-3d、直径2-3mm的AH109单克隆菌落，接入5-10mL YPDA液体培养基中，震荡打散菌落，30℃恒温，250×g震荡培养过夜（16-18h），至OD600>1.5。

2. 酵母感受态细胞的制备

1. 取适量过夜接种（约1-2mL菌液）于100mL新鲜的YPDA液体培养基，至OD600=0.2-0.3，30℃恒温，250×g震荡培养至OD600=0.4-0.6（约3h）；
2. 室温（20-25℃）离心4000×g，5min，收集菌；加入25-50mL 无菌水或TE重悬洗涤酵母沉淀细胞，离心弃上清，洗涤一次，转移至1.5mL Ep管中，用1mL 1×TE/LiAc重悬，离心弃上清，洗涤一次，然后加入1.5mL 1×TE/LiAc即为酵母感受态细胞。

3. 质粒共转

按下表进行质粒共转化至AH109感受态中。

4. 点板验证

1. 分别挑取上述4个DDO上各6个生长至2-3mm的菌落加入到100μL 0.9% NaCl 溶液中混匀；
2. 把上述四种菌液，分别点板到DDO、TDO/X、QDO/X固体培养基，每个培养基点5μL菌液。30℃倒置培养3-5d，直到待菌落长出。

优缺点分析

优点

1. 无需纯化蛋白
2. 检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表体内的真实情况
3. 检测的结果是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用
4. 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，并能分析细胞质、细胞核等多种亚细胞部位的蛋白

缺点

1. 酵母双杂并非对所有蛋白都适用，其检测的融合蛋白必须定位于核内才能激活报告基因，而融合蛋白在细胞内能否正确折叠并运至核内也是检测的前提条件，很多不能被转运到细胞核内的蛋白如胞质蛋白、膜蛋白不适用此方法
2. 假阳性较多
3. 在某些酵母菌株中大量表达外源蛋白常会带来毒性作用，从而影响菌株生长及报告基因的表达
4. 对于筛选对象和范围，应有一个合适的选择

结果分析

以pGBKT7-p53 & pGADT7-T为阳性对照，pGBKT7-Lam & pGADT7-T为阴性对照。实验结果显示，Abc & Bcd存在相互作用。

常见问题答疑

1. 酵母双杂交出现假阳性的原因？如何解决？

   由于BD融合诱饵蛋白有单独激活作用，或者其激活作用被外来蛋白激活。因此，需要作严格的对照试验，对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定，以排除假阳性。可以选择多个报告基因（HIS3，ADE2，MEL1）进行更为严格的筛选，每个报告基因的上游调控区各不相同，这可减少大量的假阳性；或者通过适当提高AbA或3-AT的浓度。另外，报告基因整合到染色体上，可以使基因表达水平稳定，消除了由于质粒拷贝数变化引起基因表达水平波动而造成的假阳性。

2. 涂板或者点板怎么设定菌浓度呢？

   涂板或者点板，生长出来的菌落为单菌落，无论菌落密集程度，只要平板菌落是单菌落的状态，不成片也不成团，那么该菌浓度在合理范围，重复实验的筛选浓度也以此为准。涂板时，建议菌浓度OD值为0.002，直径9cm的培养皿涂布100μL；点板时，控制初始菌浓度OD值0.1-0.5之间，常设0.2，按十倍梯度再稀释3个浓度，每个浓度点10μL。AbA或者3-AT的有效浓度只以OD值0.0002的菌浓度的筛选结果为准，此浓度菌在不含筛选性的平板上，理论上可以得到20个单菌落。