酱油中黄曲霉毒素B1的测定解决方案
酱油中黄曲霉毒素B1的测定解决方案
黄曲霉毒素B1（AFB1）是一种被国际癌症研究机构（IARC）列为1类致癌物的物质，被认为是目前最常见的致癌物之一。它主要存在于土壤、动植物、各类坚果（花生、核桃等），此外，在豆类、稻谷、玉米、通心粉、食用油、牛奶、调味品等中也经常发现它的身影。现行标准《食品安全国家标准 食品中真菌毒素含量》（GB 2761-2017）中规定，调味品（酱油、醋、酿造酱）的限量值为5.0μg/kg。睿科集团采用免疫亲和柱净化，分析酱油中的黄曲霉毒素B1。试样经过乙腈提取，提取液经离心、稀释后用含有黄曲霉素B1特异抗体的免疫亲和柱净化。用10mL水淋洗柱子将免疫亲和柱上的杂质除去，以甲醇洗脱免疫亲和柱，经高效液相色谱质谱仪上机分析。
图1 4种黄曲霉毒素的结构式
耗材
- 黄曲霉毒素B1免疫亲和柱3ml-20支/盒，300ng（货号：HC-QHZ-0001）
- 甲醇（Merck，色谱纯）、乙腈（Merck，色谱纯）、超纯水
标准曲线配制
黄曲霉毒素B1母液浓度为2μg/mL（2000ng/mL），稀释成100ng/mL中间工作液，用10%乙腈水初始流动相稀释，配制一条浓度分别为1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL的标准工作曲线。
样品提取与前处理
样品制备
- 取50mL离心管，称取5g酱油待测样品
- 样品中加入乙腈定容至25mL ，涡旋震荡10min，离心机4000rpm离心5min
- 移取上清液2mL至新的50mL离心管，加入 AFB1 标准品5ng ，混匀
- 用PBS溶液定容至25mL，混匀，备用
样品净化
- 免疫亲和柱在室温下，回温半小时，将步骤4中25mL溶液加入免疫亲和柱。注：免疫亲和柱中原PBS溶液不用提前排出
- 样液全部通过免疫亲和柱后，加入10mL超纯水淋洗
- 淋洗液全部通过免疫亲和柱后，压入2-3mL气体，排干残留溶液
- 向免疫亲和柱中加入1mL甲醇洗脱目标物至5mL离心管
- 洗脱完成后压入2-3mL气体，全部排出洗脱液，涡旋震荡混匀
- 洗脱液过0.22μm滤膜后直接上机检测
液相色谱参考条件
- 色谱柱：C18（柱长100mm，柱内径：2.1mm；填料粒径1.7μm）
- 流速：0.300mL/min
- 流动相：A相：5mmol/L乙酸铵溶液；B相：甲醇：乙腈=1:1
- 柱温：40℃
- 进样体积：10μL
- 梯度洗脱：32%B(0min
0.5min)，45%B(3min4min)，100% B(4.2min~4.8min) - 32%B(5.0min~7.0min)
图2 标准溶液TIC图（1、2、5、10ng/L）
样品测试
标准曲线测定
配制浓度为1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL的标准溶液，按照上述样品制备步骤进行前处理后，经GC/MSMS上机分析，得到黄曲霉毒素B1的工作曲线。
图3 黄曲霉毒素B1标准曲线
酱油加标测试
称取酱油样5g于50mL离心管，添加5ng/mL的黄曲霉毒素B1的标准品，进行上述步骤的前处理净化，样品回收率如下表1所示。
样品基质 | 回收率1·% | 回收率2·% | 平均回收率% n=2 | RSD·% |
|---|---|---|---|---|
酱油 | 101.07% | 94.39% | 97.73% | 4.73% |
结果与讨论
本文参考GB5009.22-2016《食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》，采用免疫亲和柱净化，高效液相色谱质谱检测，建立了酱油样品基质中黄曲霉毒素B1高灵敏度的前处理和分析方法，得到黄曲霉毒素B1的加标回收率在94.39%-101.07%之间，RSD值小于5%，可满足快速、准确的检测需求。
自动化解决方案
- AP 300 全自动液体处理工作站
- SPEVA 全自动样品净化浓缩仪
- EVA 80 高通量全自动平行浓缩仪
- Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪