浅析啮齿动物疼痛评估方法及特点
浅析啮齿动物疼痛评估方法及特点
啮齿类动物作为最常用的实验室动物被广泛应用于疼痛研究领域。由于疼痛特有的主观情绪反应特点，在临床研究中，疼痛的评估量化通常以患者的语言表述作为主要依据，但啮齿类动物无法用语言表达疼痛，所以常规评估方法无法适用于啮齿类动物的疼痛评估。本文将详细探讨啮齿动物疼痛评估的各种方法及其特点。
自发痛行为学评估
自发痛行为学评估是一种简便、快捷的疼痛评估方法，同时适用于大鼠和小鼠实验。因其未对实验动物产生不良刺激，所以适用于长时间、重复测量实验。为最大程度减小主观误差，测试前应对观测者进行培训并采用双盲法进行评估。
行走后足使用评分（Limb use score）
将受试动物置于平坦的透明箱内，透明箱的大小以动物能在其中自由行走为宜。观测者根据受试动物的步态和后肢使用情况对其进行评分并记录下观察期内抬足次数和抬足时间。目前主要被用于骨癌痛模型和短期内炎性痛模型的评估。该方法简便易行，对实验设备要求低，几乎适用于所有类型疼痛评估，在探索性研究中显得尤为重要。但是，由于主观性强、耗时量大、对观测者要求高，不适用于对精度要求高大样本量的研究。
连续后足使用评分（Continuously limb use score）
连续后足使用评分在观察方法和适用研究方面与行走后足使用评分不同。连续后足使用评分是在2min内每5s对受试动物进行一次疼痛评分，2h内重复两次以上取平均值。主要被用于研究周围神经病变导致的疼痛，尤其是坐骨神经结扎模型的疼痛评估。该方法在一定程度上降低了主观误差，提高了数据的精度。在评估慢性疼痛中有其优势，但不适用于短时程疼痛和急性痛的评估。
脸谱疼痛评分（Facial coding scales）
脸谱疼痛评分是一种新型自发痛行为学评估方法，同时适用于大鼠和小鼠实验。该方法通过高清电子摄像头捕捉并分析受试动物的面部表情特征，例如：眼眶的大小，眼、鼻的突出程度，耳的位置和胡须的变化等，从而精确判断实验动物的疼痛程度。有研究表明，脸谱疼痛评分在评估弱阿片类药物的镇痛效果和术后疼痛程度时有优势。有研究显示，大鼠脸谱疼痛评分更加敏感和精确。脸谱疼痛评分能在不增加受试者不良刺激的基础上有效、精确、敏感的评估大鼠、小鼠和人类三种不同生物的疼痛,并能检测出手术对实验动物的情绪影响。该方法在评估急性痛和短时程疼痛中有优势，但在临床和动物模型观察中，一部分慢性疼痛的患者和实验动物并无疼痛表情，使得该方法在评估慢性疼痛时受局限。
诱发痛行为学评估
诱发痛行为学评估方法主要用于研究痛觉过敏，诱发方式包括电、温度、机械和化学刺激。诱发痛行为学是通过诱发特定的退避行为得到固定的刺激阈值，或者用一定阈值的刺激得到实验动物的退避行为。实验前应设定刺激的最高限值，当刺激量达到限值后，即使实验动物未出现预期的疼痛反应也不应再增加刺激量，以免产生组织损伤。此类方法较为成熟，普及率高且实验器材容易获得，但观察者的操作熟练程度对实验结果影响较大，反复测试会引起实验动物产生焦虑情绪，从而影响测试结果。
电刺激（Electrical stim ulation）
电刺激是一种非特异性刺激方法。同时适用于大鼠和小鼠。研究实验动物对电刺激的疼痛阈值，最简单的方法是在单位时间增加固定的电刺激量，将出现预期行为学变化时的电量作为阈电量。电刺激常被用做控制其他动物行为学测试的工具。例如：学习无力实验、主动或被动回避、恐惧实验等。因全身作用较大，鲜有人单独研究其疼痛阈值。
热刺激（Hot stimulation）
热刺激是一种同时适用于大鼠和小鼠的疼痛刺激方法，市场上出售的热刺激仪一般均能迅速调控温度。通常，研究者判断实验动物是否出现期望的疼痛反应只需要5～10s时间，但是实验中动物会有非痛性移动，容易导致研究者的误判。
甩尾实验（Tail flick test）
甩尾实验是最古老的疼痛实验方法之一，实验中需要能自动测算出现甩尾潜伏期的装置和不使受试动物感到紧张的动物固定器。鉴于实验动物的体积，这种疼痛评估方法在以大鼠作为实验对象时较为简便，若为小鼠则对操作者的要求较高。甩尾实验适用于评估镇痛药物功效。如何使受试动物保持固定姿势而不使其产生焦虑是其操作难点。
热平板实验（Hot-plate test）
热平板实验通常被用于研究实验动物的热痛觉过敏。实验温度通常是在52～55℃之间，根据平板的材质不同，抬足的潜伏期一般为5～10s。平板表面温度不一致会增大误差，所以选择能迅速调节平板温度并能将温度精确到0.1℃的实验仪器非常重要。温度从皮肤传导至热伤害感受器再到实验动物做出逃避反射存在中枢性延期，故疼痛阈值温度一般会比皮肤热伤害感受器的阈值温度高10～15℃。热平板实验如果以出现舔足或逃避反应为实验预期，则可进行重复测量。若以出现跳跃反应为实验预期（一般是小鼠），则在实验中可能会因为实验动物主动学习和自主逃避而使实验重复性差，所以不建议进行重复测量实验。
热辐射实验（Radiant heat paw-withdrawal test）
热辐射实验与热平板实验相似，不同之处是这种实验方式可以分别测定实验动物双后肢各自的热痛阈。因其以对侧肢体热痛阈作为自身对照，所以在研究后肢局部用药及坐骨神经结扎时有优势。但是热辐射实验也是有局限的：第一，实验前必须先测定实验动物的双后肢热痛阈，对于双后肢热痛阈不同的实验动物需剔出此实验；第二，实验需要更多的时间；第三，实验需要更加精确的实验仪器。
冷刺激（Cold stim ulation）
患有神经病变的患者（9%）和患有脑卒中后中枢性疼痛（Central post-stroke pain，CPSP）的患者（23%）可能出现冷诱发痛。因环境温度和实验条件的影响，测定实验动物的冷痛阈比测定热痛阈更难。目前有丙酮实验和冷平板实验两种测试方法，主要用于以大鼠为研究对象的实验。
丙酮实验
丙酮实验是通过将丙酮滴到实验动物后肢局部来产生冷刺激，这种刺激一般不会让正常动物感到疼痛，但有冷触觉过敏的动物则会有疼痛反应。在大鼠实验中，因正常大鼠对丙酮不敏感，故丙酮适用于以大鼠为实验对象的冷触觉过敏实验。然而，正常小鼠对丙酮敏感，易产生疼痛反应，使得小鼠在丙酮实验中受限。滴丙酮后出现的抬足反应可能是由于冷刺激、化学刺激甚至是滴丙酮的机械刺激引起，且环境温度及受试动物体温的不同会影响到丙酮实验的准确度。所以丙酮在粗略观察实验中有其优势而不适合精度要求高的实验。
冷平板实验（Cold-plate test）
冷平板实验与热平板实验的实验原理相似，目前主要使用的是半导体制冷平板。适用于冷刺激痛及冷痛觉过敏的神经生物学机制和药物的疗效研究。相较于丙酮实验，冷平板实验受环境温度和受试动物体温影响较小，无毒副作用，精度更高。不能避免机械刺激的影响是其劣势。
机械刺激（The Von Frey test）
Von Frey纤维丝测试实验是源于临床的评估方法，在临床中主要用于诊断神经病理性疼痛和痛觉过敏。Von Frey纤维丝是一种钝性长约5cm的塑料丝，使用时纤维丝弯曲产生既定的压力，适用于以大鼠和小鼠为研究对象的机械触痛觉过敏实验。由于小鼠更为活泼，且足底相对较小，在使用Von Frey的实验操作中难度大于大鼠。有研究表明，周围环境的温度和湿度会影响到纤维丝的弯曲程度(Andrews,1993),所以在使用Von Frey纤维丝时应选择在相同的温度和湿度条件下进行。由于触痛阈是相对稳定的，Von Frey纤维丝被允许进行重复测量。有研究报道，不同品系的鼠对纤维丝的反应阈值并不相同，因此比较Von Frey纤维丝结果时应当选择同品牌纤维丝并对同品系鼠进行评价。现已生产出电子Von Frey测试仪，有手持式和全自动两种，与传统纤维丝相比，突破了测量范围的限制，主要适用于大鼠。两者相比，手持式更加灵活，全自动更加敏感。但是，当需要快速粗略评估大样本量大鼠的触诱发痛时传统的纤维丝可能更有优势。
化学刺激(Chemical stimulation)
化学刺激是通过将药物注入试验动物皮下或腹腔内来达到致炎目的，由于此方法简单易行且疼痛表现明显而得到广泛应用，同时适用于大鼠和小鼠。但是，因为患者一般不会受到类似的强烈化学刺激，使得此类实验的模拟性较差。
福尔马林实验（FormalinTest）
福尔马林实验是最常用于研究化学刺激诱发急性和持续性疼痛的方法。通过在实验动物足部皮下注射福尔马林溶液，诱发出与浓度成正比的疼痛行为。疼痛分为两个时相涉及两个截然不同的刺激机制：注入福尔马林液后的前几分钟为Ⅰ相痛，然后经过10min左右的静止期，接着是持续时间为20～40min的Ⅱ相痛。Ⅰ相痛是直接刺激伤害性感受器而引起的疼痛反应，主要用于镇痛药物的研究；Ⅱ相痛的产生较为复杂，包括机体炎性反应和中枢敏化。在研究阿片类药物、非甾体抗炎药、NMDA和加吧喷丁的相关作用时可以选择观察实验动物的Ⅱ相疼痛。
腹腔注射醋酸扭体实验（Acetic Acid Writ-hing Test）
腹腔注射醋酸扭体实验是一种古老的化学刺激诱发急性炎性痛的方法。即：通过将醋酸注入实验动物腹腔来诱发疼痛，观察实验动物扭体反应来判断是否出现疼痛，主要用于评估镇痛药物的疗效。该方法能直观的观察到实验动物剧烈的疼痛反应。与福尔马林实验不同的是，醋酸扭体实验的炎性痛时间更长，对实验动物的生存影响更为剧烈，可以使用对实验动物长期影响更小的热、机械、电刺激来代替。
运动相关自主行为学评估
运动相关自主行为学评估方法并不多，主要被用于疼痛、疲劳、认知功能障碍的研究中。由实验动物自主选择行为，一般不需要观测者在场，一定程度上避免了观测者对实验动物的主观影响，降低了系统误差，使实验结果更客观，提高了观察效率，也更加符合伦理学要求，是未来疼痛研究的趋势。由于实验方法种类繁多，没有经过大量的实验验证，方法成熟度不够，普及率不高，对实验仪器要求高等原因使得此类方法的使用受限。
自主滚轮测试（The voluntary wheel running test）
自主滚轮可以双向活动，实验动物进入其中可自由行走或者奔跑，用机械或电子方法自动记录实验动物在固定时间内行走或者奔跑的距离。为避免实验动物对滚轮产生恐惧心理，在测试前须让实验动物充分适应滚轮，得到相对稳定的实验基础值。自主滚轮测试是一种能简单、独立、客观的评估小鼠炎性痛的非反射性方法，能潜在的反映出小鼠是否疼痛。由于长时间的滚轮测试可能导致小鼠产生焦虑，故应控制测试时间，能取得稳定的基础值即可。为避免奔跑速度的个体差异影响实验结果，筛选出基础值相近的个体入组显得尤为重要。
转棒实验（Rota-rod test）
转棒实验原本是作为研究疲劳、肌肉力量和协调能力测试的工具而出现的。近年来转棒实验被用于研究疼痛对运动功能和肢体协调性的影响，主要适用于小鼠。将小鼠垂直放置于横梁上，横梁的旋转速度缓慢递增，实验通过测算小鼠在横梁上的停留时间来评估其疼痛程度；此类方法能较为精确的发现小鼠疼痛程度的细微差别，但不适用于研究对平衡能力或本体感觉有影响的镇痛药物的疗效。
动态负重实验（Dynamic weight bearing test）
动态负重实验首先是作为研究临床上骨关节炎患者的疼痛而出现的，同时适用于大鼠和小鼠。方法如下：将受试动物放置于透明盒内，盒底有压力转换器，让受试动物在盒内自由行走，测算出其四肢分别承受体重的比值。研究显示，在使用大鼠作为研究对象时，动态负重实验能较好的反映出大鼠在炎性痛、神经病理性疼痛及癌痛中疼痛的程度，可能可用于评估运动诱发型爆发痛。在评价镇痛药物的疗效时也可以使用此方法。
痛相关负性情绪（Pain related negative em -otions）
由于疼痛复杂的主观情绪的特点，使得痛相关负性情绪逐渐被提出。有研究表明，无论是在人类还是动物，恐惧情绪可以通过激活内生阿片类物质的释放来降低疼痛，然而焦虑却会使疼痛增强。但是，反复的恐惧体验会引发机体产生焦虑情绪从而导致持续性疼痛。例如：旷场实验、高架十字迷宫和强迫游泳等诱发实验动物产生焦虑情绪的实验，会使啮齿类动物出现痛觉过敏并延长疼痛时间。而使用安定类药物后能明显降低焦虑所引起的痛觉过敏。痛相关负性情绪测试主要被用于研究情绪对疼痛程度的影响，较少单独应用于疼痛程度评估。
参考文献：
- Inflammation-induced decrease in voluntary wheel running in mice: A nonreflexive test for evaluating inflammatory pain and analgesia[J]. Enrique J. Cobos;;Nader Ghasemlou;;Dionéia Araldi;;David Segal;;Kelly Duong;;Clifford J. Woolf.Pain,2012(4)
2.Weight bearing evaluation in inflammatory, neuropathic and cancer chronic pain in freely moving rats[J]. Pascal Tétreault;;Marc-André Dansereau;;Louis Doré-Savard;;Nicolas Beaudet;;Philippe Sarret.Physiology & Behavior,2011(3)
3.Sensorimotor and cognitive functions in a SOD1 G37R transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis[J]. Mohammed Filali;;Robert Lalonde;;Serge Rivest.Behavioural Brain Research,2011(1)
4.Weight-Bearing Asymmetry in Relation to Measures of Impairment and Functional Mobility for People With Knee Osteoarthritis[J]. Cory L. Christiansen;;Jennifer E. Stevens-Lapsley.Archives of Physical Medicine and Rehabilitation,2010(10)
5.The necessity of animal models in pain research[J]. Jeffrey S. Mogil;;Karen D. Davis;;Stuart W. Derbyshire.Pain,2010(1)
6.Pain research from 1975 to 2007: A categorical and bibliometric meta-trend analysis of every Research Paper published in the journal, Pain[J]. Jeffrey S. Mogil;;Kent Simmonds;;Maureen J. Simmonds.Pain,2008(1)
7.彭皓,黄东.啮齿类动物疼痛评估方法的研究进展[J].中国疼痛医学杂志,2014,20(07):505-508.