如何准确地稀释ELISA实验样本？样本稀释有哪些原则？

如何准确地稀释ELISA实验样本？样本稀释有哪些原则？

引用

丁香园

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https://www.dxy.cn/bbs/newweb/pc/post/50649350

ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种广泛应用于生物医学研究中的定量检测技术。在实验过程中，样本的准确稀释是确保检测结果可靠性的关键步骤之一。本文将详细介绍在ELISA实验中如何正确稀释样本，以及样本稀释时需要注意的原则和常见错误。

一个精确的ELISA检测实验，其核心在于三大关键要素：性能稳定可靠的试剂盒、造模成功且精确采集的样本、可控的实验环境且严谨细致的实验操作，这是确保实验流程无误的关键。三者相辅相成，缺一不可。在实际操作过程中，经常遇到样本稀释问题，需要进行样本稀释。

样本值高的可能情况

1. 样本中待测物的含量过高。以一些高丰度蛋白为例，如免疫球蛋白、脂联素、C肽、载脂蛋白等，在样本中的本身含量就相当高，甚至可以达到mg/mL的浓度级别。
2. 在一些经过诱导表达的细胞上清液中，特定物质会大量表达。例如，小鼠细胞在诱导后，会大量表达肿瘤坏死因子α（TNFα）；小鼠胰岛细胞受诱导后，也会大量表达胰岛素（INS）。
3. 在某些感染性疾病中，病原体相关物质会大量表达。比如乙肝表面抗原、C反应蛋白等。
4. 在疫苗原性研究中，注射疫苗的小鼠会产生大量针对该疫苗的特异性抗体，这些抗体的浓度也会非常高。
5. 对于一些经过浓缩处理的样品，如重组蛋白的产物、单克隆抗体纯品等，它们的浓度往往会被显著提高，以满足特定的实验需求。

样本稀释中容易犯的错误

1. 稀释不足。在进行样本稀释时，如果稀释倍数不足，可能会使样本中的待测物浓度过高，导致最终的检测结果偏小，无法准确反映样本中待测物的真实含量。

2. 过度稀释。另一方面，如果稀释过度，样本中的待测物浓度会被稀释到非常低的水平，这可能导致最终的检测结果偏大，因为低浓度的样本在检测时可能受到更多非特异性因素的干扰。

3. 稀释操作不规范。稀释过程中的不规范操作，特别是在进行大比例稀释时，可能会引入很多人为偏差。这些偏差可能来自于稀释液的使用不当、移液管的不准确、混合不均匀等因素，导致最终检测结果的准确性受到影响。所以，在稀释样本时，必须严格遵守操作规范，确保每一步操作都准确无误。

样本稀释的原则

当通过查询背景知识或预实验确认样本浓度过高，需要进行稀释，就应遵循以下原则，严谨的操作和计算：

1. 确保稀释倍数合理。稀释后样本测定的OD值应落在标准品最高值OD值的半量程内。以标准品最高OD值为2.4为例，稀释后的样本OD值应接近1.2，在这个范围附近，计算的浓度值最为准确。将得到的浓度值乘以稀释倍数，即可得出样本的准确浓度。

2. 稀释过程需规范操作。对于大倍比的稀释，推荐采用梯度稀释法。例如，样本要稀释200倍，可以先稀释10倍，再在此基础上继续稀释20倍，最终得到200倍的稀释效果。这种方法有助于减少误差，提高稀释的精确度。

3. 保证样本取样量适中。在样本充足的情况下，取样量不应低于5uL。越低的取样量在混匀和取样过程中更容易产生误差，影响最终的实验结果。