细胞划痕实验和Transwell迁移/侵袭实验操作的常见问题解答

细胞划痕实验和Transwell迁移/侵袭实验操作的常见问题解答

在科学研究中，细胞迁移和侵袭是理解生物体内许多重要过程的关键。本文深入探讨了常用的检测方法：细胞划痕实验和 Transwell 迁移/侵袭实验。

迁移与侵袭：有何不同？

细胞迁移

细胞迁移（又称“细胞爬行、细胞移动或细胞运动”）是细胞在接收到迁移信号或感受到其他物质的梯度后而产生的移动。细胞伸出头部伪足并建立新的黏附，通过收缩细胞体尾部在时空上交替的过程。

迁移是活细胞普遍存在的一种运动形式，胚胎发育、伤口愈合、免疫应答、组织重塑等重要生命活动过程都涉及细胞迁移。

图 1. 细胞迁移的示意图

细胞侵袭

细胞侵袭是入侵的细胞（如癌细胞）分泌蛋白酶降解胞外基质层（ECM）或基底膜基质层（BME），穿透基质或组织进入血管和淋巴管，从一个区域侵入到另一个区域的过程。

侵袭常发生于癌细胞转移等过程中，是细胞迁移的一种特殊形式。

Tips：

• 侵袭是肿瘤细胞及其微环境发生多种变化的累积结果，这些变化使细胞能够迁移并侵入健康的宿主组织。
• 当增殖的肿瘤细胞试图逃离原发肿瘤部位时，必须发生局部细胞粘附和周围组织的侵袭。在穿透血管内皮并进入血流之前，癌细胞必须通过降解胞外基质层（ECM）蛋白质成分侵入局部组织，并最终穿过基底膜。一旦进入血液循环，这些细胞就可以在次要位置形成转移性集落。

细胞迁移和侵袭都是细胞在环境中移动，依赖于细胞骨架的重组和细胞膜的动态变化，且受到细胞外信号（如趋化因子、细胞因子等）调控，与 ECM 的相互作用密切相关。但二者在机制、功能和意义方面有所区别。

细胞迁移检测

细胞迁移实验可以揭示迁移机制，用于药物筛选与评估。广泛应用于癌症研究、伤口愈合、免疫学、发育生物学等多个领域。

细胞划痕实验

细胞划痕实验，又称“伤口愈合实验”，是一种经典的检测细胞迁移运动与修复能力的方法。

原理：在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，用枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后继续培养细胞至实验设定的时间，依据划痕边缘细胞逐渐进入空白区域使“划痕”愈合的能力，判断细胞生长迁移能力。其可模拟伤口愈合过程，用于评估细胞在伤口处的迁移能力。

图 2. 细胞划痕实验的示意图

实验材料

• 细胞、培养基、Transwell 小室或培养皿、划痕工具（无菌移液枪尖、划痕刮刀或细胞划痕器）、显微镜、合适的染色试剂（如结晶紫或 DAPI）。

实验步骤

1. 细胞培养：将细胞以适宜的密度接种到培养皿或小室中进行培养，直到细胞生长到 80%-90% 汇合状态。
2. 划痕制备：使用无菌移液枪头或划痕器在细胞单层上轻轻划出一道直线或网格状伤口，确保可以形成均匀的划痕。在划痕处，尽量避免损伤周围细胞，以减少对数据的干扰。
3. 清洗细胞：轻轻用 PBS 冲洗细胞两次，以去除游离的、未附着的细胞。
4. 更换培养基：更换新鲜的培养基，保持实验条件的一致性。
5. 观察划痕愈合：用显微镜拍摄划痕的图像，记录初始划痕的状态（T0），随后在 0、12、24、48 小时等不同时间点拍照，观察划痕的宽度或迁移的细胞数。
6. 数据分析：使用图像分析软件（如 ImageJ）分析拍摄的图像，测量划痕的宽度，计算愈合面积。

图 3. 细胞划痕实验中测量 NIH3T3 细胞迁移（上）和 M3 黑色素瘤细胞迁移（下）

注意事项

• 划痕时确保宽度一致，形状尽量规则。
• 设置适当的对照组（如未处理组）以便比对实验结果。
• 定期拍照记录，确保拍摄角度一致，以便于后期比较。

Transwell 迁移实验

Transwell 迁移实验，又称“穿孔实验”，是一种广泛使用的细胞迁移实验技术。

原理：将小室放入培养板中，小室内称为上室，培养板内称为下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，上室内添加上层培养液，下室内添加下层培养液。将细胞种在上室内，由于膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

图 4. Transwell 迁移检测的示意图

实验材料

• Transwell 小室（通常为 8 μm 的孔径）、细胞、培养基、化学趋化因子、PBS、甲醇或 4% 多聚甲醛、染色试剂（如结晶紫、DAPI 或吉姆萨染色）、移液器和枪头、显微镜。

实验步骤

1. 细胞培养：将细胞以适宜浓度接种于 Transwell 的上室中培养，直到细胞生长到 70%-80% 汇合。
2. 准备下室：在下室中加入合适浓度的化学趋化因子（如生长因子、细胞因子）和培养基，建立化学梯度。
3. 实验设置：可以设置对照组（无趋化因子）与实验组（有趋化因子）以比较细胞迁移能力的变化。
4. 迁移实验：将 Transwell 小室置于培养箱中，一般孵育 24-48 小时，具体时间视细胞系和实验目的而定，以促使细胞向下室迁移。
5. 清洗细胞：用 PBS 轻轻冲洗 Transwell 上室，以去除未迁移的细胞。冲洗通常进行 2-3 次，减少背景噪声。
6. 固定细胞：用甲醇或 4% 多聚甲醛固定细胞，常见的固定时间为 10-15 分钟。固定结束后，用 PBS 冲洗细胞两次，去除多余的固定液。
7. 染色细胞：将染色剂（如 0.1% 的结晶紫溶液）加入 Transwell 的上室染色 20-30 分钟。染色后，用 PBS 轻轻冲洗 2-3 次，以去除多余的染料。
8. 观察与计数：使用显微镜观察 Transwell 膜，然后拍摄图像。选择随机区域计数迁移到膜底部的细胞。根据各组迁移的细胞数量进行比较，统计并计算迁移率。

图 5. 人间充质干细胞通过 Transwell 小室迁移

注意事项

• 选择合适的透膜孔径（通常 8 或 12 μm）或膜材料。
• 确保细胞在对数生长期，以确保活力高适合迁移。
• 在冲洗和固定细胞时，操作应轻柔，以避免损伤已迁移的细胞。
• 时间选择：不同细胞系的迁移能力不同，因此需根据具体细胞的特性调整实验时间。

细胞侵袭检测

细胞侵袭实验可用于研究细胞穿透基质或组织的能力，细胞侵袭性、揭示侵袭机制、药物筛选与评估，癌细胞转移能力及细胞对环境变化的反应。广泛应用于癌症、创伤修复、免疫反应和再生医学等多个领域。

Transwell 侵袭实验

Transwell 侵袭实验是一种广泛用于评估细胞（如肿瘤细胞）侵袭能力的体外技术。

原理：与 Transwell 迁移实验类似，但不同的是，聚碳酸酯膜的上表面需涂布一层类似基质的材料（如 Matrigel 或胶原蛋白）以模拟细胞外基质的环境，细胞会分泌酶类（如基质金属蛋白酶, MMPs）以降解基质胶才能进入下室，计数进入下室的细胞即可反映细胞的侵袭能力。该实验可了解细胞侵袭的调控机制，为相关疾病的治疗提供依据。

图 6. 细胞侵袭实验的示意图

实验材料

• Transwell 小室（通常 5 或 8 μm 孔径）、基质胶（如 Matrigel 或胶原蛋白）、细胞系、培养基、化学趋化因子、PBS、甲醇或 4% 多聚甲醛、染色试剂（如结晶紫、DAPI 或吉姆萨染色）、移液器和枪头、显微镜。

实验步骤

1. 细胞培养：将细胞以适宜浓度接种培养皿中，确保细胞生长至 70%-80% 汇合。
2. 准备基质胶：根据厂家的说明书，在冰上将所需量的基质胶（Matrigel 或胶原蛋白）溶解。在 Transwell 上室底部涂抹必要厚度的基质胶（通常为 50-100 μL）。在 4℃ 下孵育约 30 分钟- 1 小时，以确保基质胶固化。
3. 准备下室：在 Transwell 下室中加入合适浓度的化学趋化因子（如生长因子、细胞因子）和培养基。
4. 迁移实验：将细胞（通常为 1-2×105 个细胞）悬浮于适宜的培养基中，并添加到 Transwell 上室中。在培养箱中孵育 24-48 小时，具体时间视细胞系和实验目的而定，细胞则向下室迁移和侵袭。
5. 清洗细胞：用 PBS 轻轻冲洗 Transwell 上室，去除未侵袭的细胞。冲洗通常进行 2-3 次，减少背景噪声。
6. 固定细胞：用甲醇或 4% 多聚甲醛在 Transwell 上室中固定细胞，固定时间 10-15 分钟。固定结束后，用 PBS 冲洗细胞 2 次，去除多余的固定液。
7. 染色细胞：将染色剂（如 0.1% 结晶紫溶液）加入 Transwell 上室染色 20-30 分钟。用 PBS 轻轻冲洗 2-3 次，去除多余的染料。
8. 观察与计数：使用显微镜观察 Transwell 膜，拍摄图像。并选择随机区域计数侵袭到膜底部的细胞。根据各组侵袭的细胞数量进行比较，统计并计算侵袭率。

图 7. Transwell 侵袭实验中 Rac1 siRNA 抑制 SNB19 细胞通过 Matrigel 的侵袭

注意事项

• 基质胶需在冰上处理，以保持其生物活性；铺胶时，尽量垂直小室底部在小室底部中间加入，避免产生气泡。
• 确保细胞在对数生长期，以确保活力高适合侵袭。
• 在冲洗和固定细胞时，操作应轻柔，避免损伤已侵袭的细胞。
• 观察时间选择：不同细胞系的侵袭能力不同，根据具体细胞的特性和对实验的预期效果调整实验时间。

常见问题及解答

为何实验中细胞迁移不足？

可能的原因包括细胞状态不处于健康生长期、培养条件不具有适宜的培养基和生长因子、基质的厚度和成分不适合研究细胞迁移、实验环境不利于细胞迁移、孵育时间不充分等。

为什么细胞在 Transwell 实验中不能通过基质？

可能的原因包括选择的膜孔径偏小、基质胶或 Matrigel 的浓度过高、产生气泡、缺少促进细胞侵袭的生长因子或细胞因子、细胞传代次数太多失去迁移活性、细胞系不适合等。

实验过程中如何减少背景噪声？

实验后使用 PBS 彻底冲洗、使用适当浓度的染料并控制染色时间、在固定和冲洗细胞时避免损伤细胞等。

如何选择合适的细胞系进行迁移和侵袭实验？

表 3. 不同细胞系对 Transwell 小室孔径的选择。

染色后细胞分布不均一可能原因？

Transwell 小室未平衡放置于孔板中、细胞悬液未混匀、小室发生倾斜或晃动、小室的渗透膜不平等。

Transwell 小室接种细胞的加液顺序是什么？

先将完全培养基加入培养皿或孔板中（下室），再轻轻将小室放入下室中。在放入时，建议将小室稍稍倾斜，一侧先接触液面，避免垂直放入产生气泡。之后将混合均匀的细胞悬液加入小室内部。

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