暗视野观察方法：光学显微镜中的特殊观察技术

暗视野观察方法：光学显微镜中的特殊观察技术

暗视野观察方法（Dark Field Observation）是光学显微镜中一种特殊的观察技术，通过特殊的聚光镜设计，使得照明光线不直接进入物镜，而是利用被检物体反射或衍射的光线来形成图像。这种方法具有高分辨率、高对比度以及无需染色等优点，广泛应用于病原体检查、微小粒子观察以及未染色透明样品的观察等领域。

一、基本原理

暗视野观察方法基于丁达尔（Tyndall）光学效应的原理。当一束光线透过黑暗的房间，从垂直于入射光的方向可以观察到空气里出现的一条光亮的灰尘“通路”，这就是丁达尔效应。在暗视野显微镜中，聚光镜中央有挡光片，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因此视野的背景是黑的，而物体的边缘是亮的。

二、特点与优势

• 高分辨率：暗视野观察的分辨率远高于明视野观察，可达到0.02~0.004µm，因此也被称为“超显微术”。
• 高对比度：由于背景黑暗，被检物体呈现明亮的像，因此对比度高，有助于观察微小粒子或结构。
• 无需染色：暗视野显微镜常用于观察未染色的透明样品，这些样品在明视野下难以观察清楚。

三、所需附件

暗视野观察所需的特殊附件是暗视野聚光镜。这个聚光镜在普通聚光镜的基础上增加了挡光片，使光线斜射向被检物体，而不直接通过被检物体进入物镜。

四、操作步骤

1. 安装暗视野聚光镜：将暗视野聚光器装在显微镜的聚光器支架上。
2. 调节光源：选用强的光源，但又要防止直射光线进入物镜，因此一般用显微镜灯照明。
3. 加香柏油：在聚光器和标本片之间加一滴香柏油，目的是不使照明光线在聚光镜上面进行全反射，从而达不到被检物体。
4. 对焦：升降集光器，将集光镜的焦点对准被检物体，即以圆锥光束的顶点照射被检物。
5. 选择物镜：选用与聚光器相应的物镜，调节焦距，找到所需观察的物像。

五、应用范围

暗视野显微镜常用于检查病原体，如苍白螺旋体，对早期梅毒的诊断有重要意义。此外，它还常用于观察微小粒子、细胞运动以及未染色的透明样品等。

六、注意事项

• 光源强度：暗视野观察需要较强的光源才能观察到样品。
• 样品准备：玻片和盖玻片必须无疵痕且无尘土，物镜前透镜也必须清洁无尘。
• 调节装置：如果聚光器能水平移动并附有中心调节装置，应首先进行中心调节，使聚光器的光轴与显微镜的光轴严格位于一直线上。

综上所述，暗视野观察方法是光学显微镜观察方式中的一种重要技术，具有高分辨率、高对比度以及无需染色等优点，广泛应用于病原体检查、微小粒子观察以及未染色透明样品的观察等领域。