His标签蛋白纯化技术关键问题解析与解决方案

His标签蛋白纯化技术关键问题解析与解决方案

His标签蛋白纯化技术是生物医学研究中常用的一种蛋白质分离纯化方法，但实际操作中可能会遇到各种问题。本文将详细解析His标签蛋白纯化过程中可能遇到的关键问题及其解决方案。

1. 采用His标签进行蛋白纯化时，为何杂质含量偏高？

可能原因1：蛋白酶部分降解目的蛋白

• 原因阐述：在蛋白纯化过程中，蛋白酶可能处于活跃状态，从而对目的蛋白发起攻击并造成部分降解，致使最终获得的蛋白产物中混有较多杂质。
• 解决对策：向反应体系中添加多种蛋白酶抑制剂，凭借抑制剂对蛋白酶活性的抑制作用，减少目的蛋白被降解的可能性，进而提升蛋白纯化的效果。

可能原因2：杂质蛋白与镍柱亲和力较强

• 原因剖析：部分杂质蛋白可能具备与镍柱较强的结合能力，在纯化流程中与目的蛋白一同吸附于镍柱上，难以在常规条件下分离，最终导致纯化后的蛋白杂质较多。
• 解决途径：适当提高杂质蛋白与镍柱结合起始阶段的咪唑浓度，利用咪唑与镍柱的竞争结合作用，在保证目的蛋白仍能有效结合的前提下，促使杂质蛋白优先从镍柱上洗脱下来，从而提高蛋白纯度。

可能原因3：杂蛋白和目的蛋白结合

• 原因解析：在某些情况下，杂蛋白可能会与目的蛋白发生相互作用并结合在一起，这种结合态的杂蛋白在常规纯化步骤中难以与目的蛋白分离，使得纯化后的蛋白含有较多杂质。
• 解决手段：在超声处理之前向体系内添加去垢剂（如1%-2% Tritonx-100）或者还原剂，通过破坏杂蛋白与目的蛋白之间的相互作用，使二者分离，以便在后续纯化过程中将杂质蛋白去除。

可能原因4：洗涤不充分

• 原因说明：若在蛋白纯化过程中对镍柱的洗涤操作不够彻底，未能将吸附在镍柱上的杂质蛋白充分洗去，这些杂质就会随着目的蛋白的洗脱一同被收集，导致最终蛋白产品杂质较多。
• 解决措施：增加洗涤的次数，优化洗涤流程，确保镍柱得到充分洗涤，最大程度地去除杂质蛋白，提高目的蛋白的纯度。

2. 为何融合蛋白无法与金属螯合亲和层析柱结合？

可能原因1：超声功率失当致使蛋白处理异常

• 原因剖析：超声功率若过大，会使蛋白发生炭化现象，导致其结构与活性受损，无法正常与金属螯合亲和层析柱相互作用；而超声功率过小，则无法充分破坏细胞结构，使得蛋白难以释放出来，进而不能与层析柱结合。
• 解决举措：对超声功率进行调整优化，或者在超声操作之前添加溶菌酶，借助溶菌酶对细胞壁的裂解作用，提升细胞破碎效率，确保蛋白能够有效释放并具备与层析柱结合的条件。

可能原因2：组氨酸标签未能充分暴露

• 原因解析：在某些情况下，组氨酸标签可能由于空间位阻或其他因素，在天然状态下暴露不完全，使得其难以与金属螯合亲和层析柱上的金属离子形成有效结合。
• 解决方法：将纯化环境转变为变性条件，如采用4-8M脲或4-6M盐酸胍处理样品。不过需要注意的是，常规Ni-6FF(IDA)在变性条件下镍离子容易脱落，此时可选用能够耐受变性剂的螯合填料，例如月旭材料的亲和填料Ni Tanrose FF(NTA)，以保障在组氨酸标签充分暴露的情况下实现有效纯化。

可能原因3：His标签出现丢失情况

• 原因探究：其一，可能是在蛋白表达过程中His标签未能正常表达，这可能与上游构建环节有关；其二，蛋白与层析柱的孵育时间不足，导致结合不充分；其三，所螯合的金属离子并非最适宜与His标签结合的类型；其四，所使用的螯合填料载量与特异性不能满足要求。
• 解决策略：首先，通过WB检测确认His是否表达，若未表达则重新审视上游构建过程，尝试改变His-tag的位置（C-端或N-态），必要时增加His个数。其次，延长孵育时间并降低流速，给予蛋白与层析柱充分的结合时间。再者，筛选不同的金属离子进行螯合，确定最有利于与His标签结合的金属离子种类。最后，选用高载量高特异性的螯合填料，如月旭材料的亲和填料Ni Tanrose FF(IDA)，提高蛋白与层析柱的结合效率与特异性，从而解决His标签丢失导致的不挂柱问题。

3. Ni柱在经过数次使用后，载量出现下降情况，挂柱效率也变低，要如何应对这种状况呢？

可能原因：沉淀累积及蛋白异常结合致使有效位点被占

在Ni柱多次使用过程中，沉淀物质逐渐堆积，变性蛋白以及非特异性结合的蛋白会附着在柱体上，它们占据了原本可与目标蛋白有效结合的位点，并且这些杂质无法单纯依靠常规洗脱液完全清除，从而导致柱载量降低，挂柱效率变差。

解决方法：

一、温和清洗流程

此方法旨在以相对温和的试剂处理Ni柱，在不损伤柱体结构与性能的前提下，尽可能去除影响柱效的杂质。

• 针对沉淀或变性物质：使用浓度为6M的盐酸胍或8M的尿素溶液，以2倍柱体积的量对Ni柱进行洗涤。这两种试剂能够破坏蛋白质的结构，使沉淀或变性的蛋白质从柱体上解离下来。随后，再用5倍柱体积的缓冲液进行冲洗，以去除残留的盐酸胍或尿素以及被解离下来的杂质，恢复柱体的缓冲环境。
• 针对疏水结合物质：采用2倍柱体积的1% Triton X-100溶液进行洗涤。Triton X-100是一种非离子型表面活性剂，具有良好的去污和脱脂能力，能够有效去除与柱体发生疏水结合的物质。洗涤后同样用5倍柱体积的缓冲液冲洗，确保柱体干净且缓冲体系稳定。若经过上述温和清洗后，Ni柱的性能改善不明显，则需考虑采用强烈清洗方式。

二、强烈清洗流程

强烈清洗方式较为复杂，涉及多个步骤与不同试剂的使用，但能更深入地清洁Ni柱，恢复其载量与挂柱效率。

• 脱镍操作：首先使用5-10倍柱体积的脱镍缓冲液（20mM磷酸钠，0.5M NaCl，50mM EDTA，pH 7.4）对Ni柱进行洗涤。EDTA能够与镍离子形成稳定的络合物，从而将镍离子从柱体上洗脱下来，使柱体处于无镍状态，为后续的深度清洁创造条件。完成脱镍后，用5-10倍柱体积的平衡缓冲液冲洗，去除残留的脱镍缓冲液，接着再用5-10倍柱体积的双蒸水冲洗，进一步净化柱体。
• 去除离子型杂蛋白：用5倍柱体积的1.5M NaCl溶液对柱体进行洗涤。高浓度的NaCl溶液能够通过离子交换作用，去除与柱体结合的离子型杂蛋白。洗涤后用10倍柱体积的双蒸水冲洗，以清除残留的NaCl溶液。
• 去除沉淀或变性蛋白：采用1M氢氧化钠溶液处理柱体，结合时间为1-2小时。氢氧化钠是一种强碱，能够使沉淀或变性的蛋白质发生水解或变性，从而从柱体上脱离。处理后用10倍柱体积的平衡缓冲液和10倍柱体积的双蒸水依次进行冲洗，确保柱体的酸碱度恢复正常且无残留杂质。
• 去除疏水蛋白或者脂蛋白：使用5-10倍柱体积的30%异丙醇溶液对柱体进行清洗。异丙醇具有较强的溶解能力，能够有效去除疏水蛋白和脂蛋白。清洗后用10倍柱体积的双蒸水洗涤，去除残留的异丙醇。
• 生镍操作：在完成上述一系列清洁步骤后，需要重新将镍离子加载到柱体上，以恢复其亲和纯化能力。用0.1M硫酸镍溶液上柱，使镍离子与柱体结合。随后用5倍柱体积的双蒸水和平衡缓冲液进行洗涤，去除多余的硫酸镍溶液，使柱体达到可使用的平衡状态。若Ni柱在清洗后不需要立即使用，可将其保存在20%乙醇溶液中，防止微生物滋生和柱体干涸。

4. 为何融合蛋白与螯合填料结合后难以被洗脱？

可能原因1：洗脱条件力度不足致使融合蛋白滞留柱上

由于所采用的洗脱条件相对温和，未能有效破坏融合蛋白与螯合填料之间较强的结合力，从而导致融合蛋白依然牢固地附着在柱体之上，无法顺利被洗脱下来。

解决方法：优化洗脱条件以增强洗脱效果

通过逐步增加咪唑的浓度构建梯度洗脱体系，或者适当降低洗脱液的pH值，利用这两种方式来探索并确定能够实现融合蛋白最佳洗脱效果的条件组合，促使融合蛋白从螯合填料上有效解离。

可能原因2：低pH洗脱引发镍离子脱落问题

当采用降低pH值的方法进行洗脱操作时，如果pH值低于3.5，会导致螯合填料上的镍离子发生脱落现象。这不仅会破坏填料的亲和性能，还会使洗脱过程失去对融合蛋白的特异性洗脱能力，进而导致融合蛋白无法正常洗脱。

解决方法：调整洗脱策略避免镍离子脱落

摒弃低pH值洗脱的方法，转而采用咪唑竞争性洗脱方式。咪唑能够与融合蛋白竞争结合填料上的镍离子，在不影响镍离子与填料结合稳定性的前提下，实现融合蛋白的洗脱，确保洗脱过程的有效性和填料的可重复使用性。

可能原因3：蛋白沉淀于柱体之上阻碍洗脱

在某些情况下，融合蛋白可能会在柱体上发生沉淀现象，这可能是由于上样量过大、蛋白浓度过高或者环境因素等导致的。沉淀后的蛋白会紧密附着在柱体表面，严重阻碍洗脱过程的顺利进行。

解决方法：针对性处理柱上蛋白沉淀问题

• 从源头上控制上样量，减少进入柱体的蛋白总量，或者在洗脱过程中采用咪唑的线性梯度洗脱方式替代分步洗脱，以此降低蛋白在柱体上的局部浓度，减少沉淀形成的可能性。同时，可以尝试向洗脱缓冲液中添加去污剂（如试用不同浓度的去污剂）或者改变NaCl的浓度，通过改变洗脱环境的理化性质来溶解沉淀的蛋白。另外，还可以考虑在变性条件（如使用4-8M脲或4-6M盐酸胍）下进行洗脱，使蛋白结构发生改变，从而从柱体上脱离。
• 若蛋白在柱上已经发生变性固化，则使用0.5M氢氧化钠溶液对柱体进行清洗。氢氧化钠具有较强的碱性和去污能力，能够破坏变性固化蛋白与柱体之间的相互作用，使蛋白从柱体上解离并被清洗掉，但在使用过程中需要注意其对柱体材料可能造成的损伤，使用后需对柱体进行充分的中和与清洗处理，以恢复柱体的性能。

可能原因4：非特异性相互作用干扰洗脱

融合蛋白与螯合填料之间可能存在非特异性的疏水相互作用或者其他类型的非特异性相互作用，这些额外的相互作用会增强蛋白与柱体的结合力，使得在常规洗脱条件下难以将融合蛋白洗脱下来。

解决方法：削弱非特异性相互作用促进洗脱

向洗脱缓冲液中添加非离子去污剂（如2% Triton X-100），非离子去污剂能够降低蛋白与柱体之间的疏水相互作用，破坏非特异性结合。或者适当增加NaCl的浓度，利用盐离子的屏蔽作用减少蛋白与柱体之间的静电相互作用等非特异性相互作用，从而提高融合蛋白的洗脱效率。

可能原因5：填料表面蛋白聚集影响洗脱

在填料表面可能会形成高密度的融合蛋白聚集现象，这可能是由于所选用的填料载量与实际样品蛋白含量不匹配，载量过高导致蛋白在填料表面过度堆积而形成聚集。聚集后的蛋白群体与填料之间的相互作用复杂且紧密，不利于洗脱过程的进行。

解决方法：合理选择填料载量避免蛋白聚集

在进行实验之前，根据样品中融合蛋白的含量和性质，选择合适载量的填料，避免盲目追求高载量。合适的填料载量能够使蛋白在填料表面均匀分布，减少聚集现象的发生，从而有利于后续的洗脱操作，提高融合蛋白的回收效率。