“肠”驱直入：真菌杀虫新途径
“肠”驱直入：真菌杀虫新途径
昆虫病原真菌是昆虫病原体中的最大类群，是自然界昆虫种群消长的重要调节因子，已被开发成为环境友好的微生物杀虫剂，用于防治多种农林和卫生害虫。然而，目前应用的生防真菌只能通过体壁途径侵染害虫，其防治效果易受不利环境因素（如干旱、高温和紫外线等）的影响，极大地限制了真菌杀虫剂的推广应用。本研究的初衷在于破译杀虫真菌不能经由肠道途径侵染昆虫的制约因素，寻求并提供使杀虫真菌获得肠道侵染能力的可能的新方法。研究过程中，我们意外地发现了一种新的白僵菌变种─球孢白僵菌大孢变种（Beauveria bassianavar.majus）（Bbm），它可以通过体壁和前肠双途径感染鳞翅目幼虫。值得注意的是，昆虫前肠是以往未曾报道的病原菌入侵途径。这一新发现对昆虫病原真菌仅通过体壁侵染昆虫的传统理论提出了挑战。
导读
与病原细菌和病毒经肠道侵染昆虫的途径不同，病原真菌一直被认为只能通过体壁侵染进而杀死昆虫。这种体壁侵染方式虽然在防治具有刺吸式口器的害虫上具有独特优势，但是真菌的感染和生防效率极易在干旱、高温和紫外线等不利环境因素的影响下大大降低。相比之下，昆虫消化道的湿润环境有利于真菌孢子的快速萌发和生长。因此，近百年来，许多科学家致力于寻找能够通过肠道侵染的杀虫真菌，这对于提高真菌杀虫剂的防治效果具有重要的意义。最近，中国科学院分子植物科学卓越创新中心（植物生理生态研究所）王四宝研究员团队在The Innovation杂志首次报道了昆虫前肠可作为病原真菌侵染途径的新发现。该研究还揭示了球孢白僵菌大孢变种通过碱性信号通路Aia-PalC-PacC，快速响应和耐受昆虫碱性肠道环境的分子机制。这一突破性新发现不仅颠覆了病原真菌仅能通过体壁侵染昆虫的传统理论和认知，也为研发“体壁+肠道”双重途径侵染的新型真菌杀虫剂开辟了新方向并奠定了理论基础。
真菌杀虫剂的应用挑战
在真菌杀虫剂的实际应用过程中，病原真菌孢子萌发极易受到高温、低湿、强紫外线等不利环境因素的制约，导致这些通过体壁侵染的生防真菌的实际防治效果美中不足。昆虫消化道环境湿润且相对稳定，是病原细菌和病毒侵染昆虫的途径。近百年来，科学家们一直致力于探索发现能够通过肠道途径侵染昆虫的病原真菌，但始终未能获得直接证据证明病原真菌可以通过肠道感染昆虫。普遍观点认为，昆虫肠道内不适宜的pH环境、众多的消化酶以及多样的肠道微生物可能抑制了真菌孢子的萌发。长久以来，人们普遍认为体壁途径是昆虫病原真菌侵染昆虫的唯一途径。
球孢白僵菌Bbm的双重侵染途径
在探索肠道细菌是否影响真菌肠道侵染昆虫的研究中，王四宝研究员团队意外地发现了一株也能够通过肠道侵染鳞翅目昆虫的球孢白僵菌Bbm菌株。通过口服饲喂的研究方法，发现Bbm能够通过肠道侵染家蚕和豆天蛾幼虫。这种侵染方式不仅能快速杀死低龄幼虫，而且对即将化蛹的老熟幼虫同样致命。即使在干燥环境条件下，该真菌也能够通过肠道有效感染鳞翅目幼虫。另外，肠道菌群的存在与否不影响Bbm的肠道侵染能力。重要的是，与单一途径侵染相比，经体壁和肠道双途径侵染能够显著增强Bbm的杀虫效力（图2）。
图2 球孢白僵菌Bbm菌株兼具体壁和肠道双途径侵染昆虫的能力
前肠是真菌肠道侵染的关键部位
通过解剖和组织切片观察，即便在家蚕幼虫的中肠和后肠腔内发现了Bbm的分生孢子，但这些孢子并未萌发。仅在前肠内观察到真菌孢子的萌发，并进一步形成菌丝穿透前肠内壁。以上观察表明，前肠是球孢白僵菌Bbm通过肠道感染昆虫的入侵部位（图3）。
图3 组织切片观察发现前肠是真菌通过肠道感染昆虫的入侵部位
Bbm菌株的分类地位
基于核糖体rDNA-ITS序列的系统发育分析表明，具备肠道侵染能力的 Bbm菌株与非肠道致病性菌株ARSEF252和ARSEF2860的亲缘关系很近，同属于球孢白僵菌（Beauveria bassiana）。进一步形态学分析发现Bbm菌株的分生孢子显著大于非肠道致病性菌株。因此，Bbm菌株属于球孢白僵菌的变种，根据孢子形态将其命名为球孢白僵菌大孢变种（Beauveria bassianavar. majus）（图4）。
图4 具备肠道侵染毒力的Bbm菌株属于球孢白僵菌大孢变种
Bbm菌株的碱性环境适应机制
无论是通过体壁侵染还是肠道途径侵染，真菌分生孢子萌发都是真菌产生致病力的第一步。鳞翅目幼虫前肠环境呈现强碱性（pH 10.0~11.0）。研究发现，Bbm菌株的分生孢子在强碱性条件下具备快速萌发的能力。真菌耐碱性能力主要由进化保守的Pal-pH响应信号通路中的转录因子PacC调控。敲除PacC导致Bbm菌株的耐碱性能力和肠道致病性显著减弱。在碱性条件下，Bbm菌株中PacC转录表达迅速上调，同时PacC被快速水解活化（图5）。
图5 转录因子PacC调控Bbm菌株耐碱性和肠道致病性
PacC蛋白的水解活化依赖于上游传递碱性pH信号的PalC。在碱性条件下，Bbm菌株PalC基因快速响应并显著上调表达。敲除PalC能够抑制碱性条件下PacC蛋白的水解活化，并显著降低Bbm菌株的耐碱性和肠道侵染毒力。比较基因组分析发现，与非肠道致病性菌株相比，Bbm菌株PalC邻近基因Aia存在一个249 bp的片段缺失，导致Aia基因在碱性条件下被快速诱导表达。因此，BbmAia作为碱性诱导激活子（alkaline inductive activator，Aia），正向调控上游邻近基因PalC的表达，PalC促进PacC蛋白的水解活化，活化的PacC入核，激活下游碱性pH诱导基因的表达。这一新的pH响应调控通路Aia-PalC-PacC增强了Bbm菌株耐受昆虫前肠的强碱性环境，进而实现经由肠道侵染昆虫的能力（图6）。
图6 Bbm菌株通过Aia-PalC-PacC调控通路快速适应昆虫肠道强碱性环境
研究还发现，在非肠道致病性菌株中异源表达BbmPacC活性短肽能够使其获得肠道侵染能力（图7）。
图7 异源表达具有活性的BbmPacC短肽赋予ARSEF252菌株具备肠道侵染毒力
总结与展望
以往认为病原真菌只能通过体壁途径侵染昆虫。本研究首次发现，球孢白僵菌大孢变种Bbm能够通过体壁和前肠两种途径侵染鳞翅目幼虫。Bbm适应鳞翅目幼虫肠道强碱性环境的关键在于其进化出的碱性诱导激活子Aia。在碱性条件下，该激活子能够正向调控邻近的碱性pH信号响应基因PalC的表达，PalC进而有效促进Pal-pH信号通路中关键转录因子PacC的水解活化。活化的PacC进入细胞核，激发耐碱性相关基因的表达，从而增强Bbm菌株对强碱性前肠环境的快速响应和耐受性，从而获得经由肠道侵染昆虫的能力。这项发现挑战了教科书中关于病原真菌只能经由体壁途径侵染昆虫的传统理论，也为真菌杀虫剂的应用提供了新的思路。体壁和肠道的双重侵染途径有望显著增强真菌杀虫剂的防控效果，为开发新一代真菌杀虫剂开辟了新方向。