流式细胞术中过夜染色的优势与应用

流式细胞术中过夜染色的优势与应用

流式细胞术是一种强大的细胞分析技术，广泛应用于生物医学研究中。在流式细胞术中，过夜染色（即延长抗体孵育时间）是一种可以显著提高实验结果质量的技术。本文将详细介绍过夜染色的优势及其在流式细胞术中的应用。

抗原抗体的结合机制

抗体结合是由非共价键驱动的可逆反应，包括氢键、疏水键、静电键和范德华键。抗体在相对较高的浓度（μg/ml）下孵育15至60分钟，抗体结合遵循非线性 S 形曲线。延长孵育时间，抗体数量级的减少可以达到相似的结合水平，同时由于抗体-抗原平衡更有可能通过延长孵育时间实现，这可能使实验之间的变异性降低。

过夜染色的优势

提高灵敏度和分辨率

延长孵育时间可增加阳性信号。例如，随着孵育间隔以15分钟为间隔延长，固定浓度的CXCR5-PE-eFluor610表染小鼠脾细胞MFI增加。使用 16 至 20 小时的较长孵育时间时，与较短孵育相比，获得相同的 MFI 所需的抗体减少了 10 倍。

图1. 时间和抗体浓度对小鼠CXCR5染色的影响。（A）在指定的孵育时间后，活的 C57BL/6 小鼠脾细胞上 CXCR5 染色的代表性直方图。（B）染色指数（n = 5，平均值 ± SD）。

减少实验间变异性和批次效应

对于 16 至 20 小时的更长孵育时间，这种变异性会降低，因为抗体-抗原复合物更接近平衡状态。在抗体-抗原相互作用的平衡点，抗体结合的导通率等同于关断率，因此检测到的信号将更加稳定，可以将独立染色的批次效应降低到几乎可以忽略不计的程度。

图5. 增加孵育时间可减少批次效应。（A）SIGLEC-8 在 3 个独立实验中对来自同一供体的 CD45+ SSChi CD16- 细胞的代表性染色和 MFI。（B）CD123 在 3 个独立实验中对来自同一供体的 CD45+ SSClo、CD3−、CD19−、CD14−、CD16− 细胞的代表性染色和 MFI。（C）来自同一供体的人类全血免疫表型数据，经过三个独立实验，染色 30 分钟或 16 小时。使用参数 CD45、SSC-A、CD4、CD8、CD127、CD16、CD19、CD3、CD123、CD20、CD25、Fcer1a、CD11c、SIGLEC-8、CD56、CD14 和 HLA-DR 生成 tSNE 图。（D）染色 30 分钟或 16 小时的样品之间的交叉熵距离。（E） 两年内四次实验的小鼠数据。使用 CD4、CD8、Foxp3、CD103、Neuropilin、CD44、CD62L、Ki67、ICOS、PD-1、CTLA-4、CD25、KLRG1、CD69、ST2 和 Helios 参数在 CD3+ T 细胞上生成 tSNE 图。（F）小鼠样本之间的交叉熵距离（批内变化）或批次（批次间变化）。

降低成本

对于更长的孵育时间，与 30 分钟染色的最佳抗体量相比，过夜染色所需的抗体通常少 5 到 100 倍。因此，延长抗体孵育期是高参数流式细胞术中更具成本效益的方法。

图6. 过夜孵育可提高成本效益。（A）1 小时孵育与过夜孵育相比最佳滴定每种抗体的成本 。n = 439。（B）高参数（23-50 色）Panel成本。

提高Panel设计的灵活性

通过适当结合固定选择和过夜染色来提高抗体染色的信噪比，可以提高检测组合设计的灵活性。在常规染色条件下，一些染料的亮度不足以用于检测某些抗原。然而，通过过夜孵育，可以明显解析 Tbet 表达，同时保持特异性。

图7. 通过过夜染色增强对低表达标记物或暗淡荧光素的检测。（A）在指定时间和稀释度下对活脾细胞进行 CD3-BV570 染色。（B）NK 细胞上T-bet-BV605 染色。（C）NKp46-PerCP-Cy5.5染色。

减少染料间相互作用的干扰

由于染料之间的相互作用与抗体浓度成正比，降低抗体浓度也可以减少聚合物聚集，从而获得更清晰、更可解释的数据。

图8. 在过夜染色中，抗体浓度较低，可减少非特异性结合。（A）30 分钟染色与过夜染色中的BV染料相互作用。（B）PE-Cy5 串联物在 30 分钟内与过夜表面染色时，与巨噬细胞的非特异性结合。

实验条件优化

在仔细设计流式细胞术panel后，下一步是测试和优化panel，以确保每个标记物都得到充分的分离。由于过夜抗体孵育的分离度通常有所提高，建议以此滴定每种抗体为起点，进行 30 至 60 分钟的表面染色、过夜表面染色和过夜细胞内染色。

图9. 优化染色流程。

抗体滴定

滴定对于最大限度地提高每种抗体的分离度是绝对必要的，不同的染色条件会影响所需的最佳抗体量。例如，在未固定的细胞上用CD3-SparkBlue550对小鼠脾细胞进行染色30分钟，需要1:200的最佳稀释度。然而，对于固定细胞用相同抗体染色过夜，1:200会导致表达 CD3 的细胞的背景信号扩大和分辨率降低，而1:10,000 的稀释度是最佳的。

图10. 滴定对于最大限度地提高灵敏度至关重要。（A）CD3-Spark Blue 550 的滴定。（B） 在活 CD4+CD3+ T 细胞上以指定的稀释度对固定并使用 eBioscience Foxp3 Fix/Perm 试剂盒透化的细胞进行 PD-1 细胞内过夜染色。

固定剂的选择和对表位的影响

在多数情况下，固定和透化后的抗体染色可提升灵敏度，少数除外如CD69。然而，所使用的固定剂类型会极大地影响抗体与其抗原结合的程度。流式细胞术最常用的固定剂是甲醛基的，活性浓度为1%至4%的甲醛。甲醛与氨基酸反应，将相邻的蛋白质连接成刚性基质。这保留了细胞结构，但如果表位被化学反应改变，也可能影响抗体识别表位的能力。

图11. 固定剂的选择会影响染色强度和特异性。（A）代表性直方图显示固定与否下，小鼠脾细胞 CD11b-BV510 过夜染色结果。（B）不同固定剂不同稀释度下进行CD11b染色的染色指数。（C）不同固定剂、不同浓度，各种抗体对小鼠脾细胞进行过夜染色的结果。除了CD69不固定最好，其他marker在eBioscience Foxp3/Transcription Factor Fixation Buffer作用下结果均不错。

控制非特异性染色

理想的流式对照是具有相似自发荧光谱的细胞，且已知不表达抗体识别的抗原，如野生型细胞和敲除细胞，但通常不可行。另一个有用的选择是内部参照，它是染色样品中的一种细胞类型，经验上已知不表达该抗原。且染色体系和条件完全相同，仍然需要选择自发荧光一致的内参，如不能选择背景信号更高的粒细胞作为淋巴细胞的内部参照。事实证明，在合适的滴度下，延长孵育时间并不会增加非特异性染色，仍可保持结果的特异性。

图12. 对照证实过夜染色可保持特异性。（A）对 WT 或 IL-2 缺陷的小鼠 CD4+ T 细胞进行 IL-2 染色。（B） 在有或没有 IL-2 刺激的小鼠 CD4+ T 细胞上进行 pSTAT5 和 Foxp3 染色。

对染色和活力的影响

在某些情况下，对未固定的细胞进行过夜染色将产生最佳结果。除了表面表达是所需生物学读数的情况外，表面染色可以更好地检测某些蛋白质，或者当细胞内染色相同的抗原时可能导致非特异性结合。其中一个例子是趋化因子受体CXCR5，与常规表面染色或过夜细胞内染色相比，它在过夜表面染色的不同滴定中具有显著提高的信噪比。

要确定未固定细胞的过夜染色是否是实验的正确选择，一个关键的考虑因素是活力。对于通常状况良好的细胞，例如新鲜分离的小鼠脾细胞，对健康细胞进行过夜染色仅导致 ∼5% 的整体活力损失。在这种情况下，大多数细胞类型的存活率保持在 90% 以上，当用 PBS-FCS-EDTA 染色时，Treg 的存活率下降幅度最大，约为 80%。更脆弱的细胞，例如那些经过长时间消化后冷冻保存或从组织获得的细胞，可能对过夜孵育更敏感，因此在孵育前固定细胞可能是更合适的策略。

图13. 缓冲液组成和初始活力会影响过夜孵育期间的细胞存活。（A）小鼠脾脏或小肠固有层白细胞中过夜孵育前的白细胞 （CD45+） 活力（n = 3，平均值 ± SD）。（B）缓冲液选择对过夜孵育中白细胞活力的影响。在过夜染色前，对单个 CD45+ 白细胞的细胞活力进行评估，这些白细胞对可固定的活力染料呈阴性。（C）小鼠脾脏中各种免疫细胞类型在不同缓冲液中孵育过夜后的活力。

便利性和工作条件

使用过夜染色方案的研究人员可能会从这种方法中获得额外的好处，因为这种方法将实验分解为两天。对于大型实验，样品制备可能会占用工作日的大部分时间，使研究人员在下午繁忙的流式细胞仪上竞争有限的时间，或者运行到深夜。较长的白天更有可能导致匆忙的采集或因疲劳而出错。通过将细胞染色过夜并在第二天早上返回采集，安排更从容，结果更稳定可靠。

总结

高参数流式细胞术是各种应用中生物询问不可或缺的技术。流式细胞术中要识别的每种抗原在表达量和位置方面具有不同的特征，用于检测这些抗原的抗体在亲和力、亮度和结合特征方面也各不相同。尽管如此，常规流式细胞术方法通常使用通用的、相对较短的染色条件来检测所有这些不同的条件。这通常会导致染色不合格，难以从背景荧光水平中正确识别阳性表达。通过优化每种抗原的染色条件，可以大大提高分辨率，从而实现更准确的标记物表达定量。这些优化的条件还具有联动效应，可降低实验成本并提高Panel设计的灵活性。因此，多花一天时间优化目标抗原的染色条件，可以在获得更便宜、更准确的流式数据方面带来好处。