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揭秘RNA干扰技术：从基因编辑到未来医学革命的奥秘

创作时间:

作者:

@小白创作中心

揭秘RNA干扰技术：从基因编辑到未来医学革命的奥秘

引用

来源

https://m.xianjichina.com/special/detail_558165.html

RNA干扰技术是近年来生命科学研究领域的一项重大突破，它不仅改变了我们对基因表达调控的理解，更为疾病治疗、农业生产等多个领域带来了革命性的变化。本文将为您详细解析RNA干扰技术的诞生背景、原理机制、特点优势及其在各个领域的应用前景。

在生命科学的浩瀚星空中，RNA干扰技术如一颗璀璨的新星，散发着神秘而强大的光芒。自其诞生以来，便以惊人的速度改变着我们对生命本质的理解，为众多领域带来了革命性的突破。

RNA干扰技术的发现并非偶然，而是众多科学家在漫长的岁月中不断探索和积累的结果。从早期在不同生物中的零星发现，到后来关键突破的出现，它犹如一把神奇的钥匙，开启了一扇通往未知世界的大门。在这个充满奇迹与挑战的领域里，RNA干扰技术正以其独特的魅力，吸引着无数科学家投身其中，探索生命的奥秘，为人类的未来开辟出更加广阔的道路。

RNA干扰技术的诞生与发展

早期探索

1984年，Izomt等在研究小鼠L细胞时发现反义信使RNA会干扰与之同源的基因表达，但具体机制当时无法弄清。1990年，Jorgensen等将紫色素合成基因插入矮牵牛花中，希望能使花朵的颜色变得更深，结果却得到了白色花朵的矮牵牛花。不仅插入的基因没有表达，而且自身的色素合成基因也受到某种程度的抑制。1992年，Romano和Macino在粗糙链孢霉的研究中，发现导入外源基因可以抑制具有同源序列的内源基因的表达。1995年，Guo等用反义RNA技术阻断线虫中par-1基因的表达时，意外地发现正义和反义RNA都能抑制基因的表达，但遗憾的是当时无法解释这一现象。

关键突破

1998年，法尔和梅洛通过将体外转录得到的单链RNA和双链RNA分别纯化后注入线虫体内，发现双链RNA能够比单链RNA更高效的特异性阻断相应基因的表达，于是他们称这种现象为RNA干扰。该研究首次证明此过程属转录后的“基因沉默”，并证明了小干扰RNA分子是某些基因抑制现象的“幕后使者”，相关成果在《自然》杂志上发表。随后，2001年，Elbashir等率先用小分子RNA在培养的哺乳动物细胞中诱导特异性基因沉默，从而开始了RNA干扰技术在哺乳动物细胞中的研究应用。2002年，Brummelkamp等首次成功构建了小发夹RNA表达载体，并发现该载体可特异、有效地降低目的基因表达。2004年，Morris等用RNA干扰技术实现了对人体中基因的抑制作用。

RNA干扰技术的原理机制

起始阶段

双链RNA的来源可以是外源导入，如通过化学、物理或生物方法导入细胞；也可以由转基因、转座子、病毒感染等各种方式引入细胞内。这些双链RNA一旦进入细胞，就会被一种称为Dicer的特定酶识别。Dicer酶属于RNase III家族，具有两个催化结构域、一个解旋酶结构域和一个PAZ结构域，在催化过程中以二聚体的形式出现，其催化结构域在双链RNA上反平行排列，形成四个活性位点，其中两侧的两个位点具有内切核酸酶活性。在这个过程中，Dicer酶以ATP依赖方式切割双链RNA，将其切割成21～23个核苷酸长的小分子干扰RNA（siRNA）。这些siRNA具有特定的结构特征，为长约21～23bp的双链RNA，具5'单磷酸和3'羟基末端，互补双链的3'端均有一个2～3nt的单链突出。

效应阶段

双链siRNA首先被包裹进入一个多蛋白复合体中，形成RNA诱导的沉默复合体（RISC）。siRNA的3'和5'末端对其能否被包裹进入RISC复合体中非常重要。在ATP存在的情况下，RISC被激活，双链siRNA解开。被激活的RISC以单链siRNA作为向导，去寻找与之互补的靶mRNA。然后，内切核酸酶在siRNA附近开始切割mRNA。最后，切割下来的RNA被外切核酸酶完全降解。切割位点多为尿嘧啶。

循环放大阶段

在效应阶段，活化的RISC结合mRNA后，内切核酸酶将mRNA切割成12～23nt的片段，特异性地抑制了靶基因的表达。同时释放出来的siRNA可以作为一种特殊的引导物，在RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP）作用下，以靶mRNA为模板合成新的双链RNA，然后由Dicer切割产生新的siRNA，新siRNA再去识别新一组mRNA，又产生新的siRNA，经过若干次合成切割循环，沉默信号就会不断放大。这种称为靶序列指导的扩增机制赋予了RNAi的高效性和持久性。此外，在植物中，RNAi信号可以通过胞间连丝在短距离的相邻细胞之间传递，也可以通过植物里纵横交错的脉管系统进行长距离的传送。在动物中，RNAi信号的扩散需要特殊的蛋白参与，如在线虫中鉴定出了一种由sid21基因编码的跨膜蛋白，能在膜上形成跨膜通道供沉默信号通过，而在哺乳动物中也存在SID21蛋白同源物。

RNA干扰技术的特点优势

高效性与ATP需求

Elbashir等在研究中发现分别为25nmol/L与100nmol/L的起始双链RNA产生的结果一样，高浓度起始更有效，将双链RNA浓度降低到1.5nmol/L时基因沉默效果变化不大，只有当浓度降低到0.05nmol/L时，沉默效果才消失。Holen等也证实1～100nmol/L的双链RNA浓度对基因沉默效果一致。这表明双链RNA介导的基因沉默效率相当高。Zamore等认为RNAi过程中至少有两个步骤需要能量供给：一是长的双链RNA被Dicer所酶切产生双链RNA；二是在双链RNA与RISC结合解链后形成有活性的RISC。少量的双链RNA就能诱发整个生物体的基因沉默，原因在于RNA干扰存在级联放大效应。例如，在RNA多聚酶的作用下，双链RNA得到复制，从而产生更多的双链RNA，进而产生更多的小分子干扰RNA，增强了基因沉默效果。

特异性及影响因素

Elbashir等和Brummelkamp等发现在21～23个碱基对中有1～2个碱基错配会大大降低对靶mRNA的降解效果。结果还表明双链RNA对mRNA的结合部位有碱基偏好性，相对而言，GC含量较低的mRNA被沉默效果较好。这体现了RNA干扰技术的高度特异性，只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA。例如，在特定基因的研究中，如果双链RNA与靶mRNA的碱基匹配度高，尤其是GC含量较低时，能更高效地触发基因沉默，反之则会降低沉默效果。

位置效应与竞争效应

Holen等根据人TF不同的位置各合成了4组双链RNA来检测不同位置的双链RNA对基因沉默效率的影响。在不同浓度和不同类型的细胞中，hTF167i和hTF372i能够抑制85%～90%的基因活性，hTF562i只能抑制部分基因活性，而hTF478i则几乎没有抑制基因的活性。他们还以hTF167为中心依次相差3个碱基对在其左右各合成了几组双链RNA，发现它们所能抑制该基因活性的能力以hTF167为中心依次递减。特别是hTF158i和hTF161i只与hTF167i相距9个和6个碱基，但几乎没有抑制该基因活性的能力。Hoten等将10nmol/L和30nmol/L的hTF167i相比，两者沉默基因效果无差异，但将20nmol/L基因抑制效果很差的PSK314i和10nmol/L的hTF167i相混和后，hTF167i产生的抑制效果明显降低，体现了竞争效应。

可传播性及局限

在线虫中，双链RNA可以从起始位置传播到远的地方，甚至于全身。Feinberg和Hunter在线虫细胞膜上发现一种跨膜蛋白SID1，它可以将双链RNA转运出细胞，因此系统性的RNAi包括了SID1介导的双链RNA在细胞间的运输。但在果蝇上并未发现有此基因的同源物，因此在果蝇上通过注射产生的RNAi不能扩散。这表明RNA干扰的可传播性在不同生物中存在差异，具有一定的局限性。

生物安全性与环境友好性

双链RNA分子的设计仅作用于特定病原菌，对人体及其他非靶标生物无毒害。其生产过程清洁化，而且在土壤和水流中72小时内即可降解。例如，在农业领域中，RNA杀菌剂对环境友好，施用后很容易被降解成植物肥料，这些植物肥料会被作物再次吸收利用，对农作物和环境都极为友好。在害虫防治中，RNA干扰技术通过构建特异性针对害虫靶基因的dsRNA，导入害虫体内后触发RNAi反应，沉默靶基因的表达，从而达到防治害虫的目的，同时对非靶标生物如天敌昆虫、有益微生物等影响较小，具有较高的生物安全性和环境友好性。

RNA干扰技术的应用领域

治疗人体疾病

RNA干扰技术在治疗人体疾病方面具有广阔的前景。根据某种疾病的致病基因，设计出针对该基因mRNA的小分子干扰RNA，抑制或封闭该致病基因的表达，达到治疗疾病的目的。在理论上，可以用于治疗肿瘤、传染病以及遗传性疾病等。

在肿瘤治疗方面，RNAi技术可以通过靶向沉默癌基因或促癌基因，抑制癌细胞的生长、增殖和转移。例如，研究发现癌基因ras在大约20%的癌症中因突变而发生了过表达或活化，通过RNAi技术可以抑制ras基因的表达，从而达到治疗癌症的目的。目前，RNAi技术正在被开发用于治疗多种癌症，包括肺癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌和前列腺癌等。

在传染病治疗方面，RNAi技术可以被用于治疗病毒感染，因为它可以靶向沉默病毒的基因，从而抑制病毒的复制。例如，针对HCV RNA的siRNA转染细胞后，可使HCV RNA降低80倍；siRNA还可以特异抑制HCV RNA复制、阻止相关蛋白表达。目前，RNAi技术正在被开发用于治疗多种病毒感染，包括艾滋病病毒（HIV）、乙肝病毒（HBV）、丙肝病毒（HCV）和流感病毒等。

在遗传性疾病治疗方面，RNAi技术可以被用于治疗遗传性疾病，因为它可以靶向沉默致病基因，从而纠正遗传缺陷。例如，对于亨廷顿舞蹈症、囊性纤维化、镰状细胞贫血和脊髓性肌萎缩症等遗传性疾病，RNAi技术可以通过靶向沉默致病基因，达到治疗的目的。

农业领域应用

在农业领域，RNA干扰技术在植物病原菌防治、害虫防治及作为生物农药方面具有重要应用。

对于植物病原菌的防治，RNAi技术可以通过干扰控制病原菌发育或重要行为的关键基因，阻碍病原菌正常的生长发育和繁殖，从而有效控制病原菌为害。例如，通过干扰植物病原菌的致病基因，降低其致病性，保护植物健康生长。

在害虫防治方面，RNA干扰抗病虫技术是利用RNA干扰技术沉默控制害虫发育或重要行为的关键基因，阻碍有害生物正常的生长发育和繁殖，甚至直接导致有害生物死亡，从而有效控制病虫为害。该技术的最大特点是靶标专一性强，对天敌等有益生物风险小，不改变病虫的基因组，对生态系统相对安全。其主要成分dsRNA在生物中普遍存在，在自然环境中易降解，因此无毒、残留时间短，是一种绿色环保的抗病虫技术，对作物病虫害防控展现了巨大的应用前景。

作为生物农药，RNA农药具有特异性强、开发成本低、绿色安全等优势。联合国粮农组织公布，全球每年高达40%的粮食作物因病虫害而遭受损失，而化学杀虫剂的大量使用不仅产生严重的抗性治理问题，而且给环境安全、食品安全和人类健康都带来巨大的风险，亟需研发新型高效生物农药以实现绿色防控。RNA农药既能防治病虫害又不影响农作物遗传表达，具有化药与转基因作物的优势结合，被誉为农药史上的第三次革命。例如，上海交通大学农业与生物学院唐雪明团队在Frontiers in Bioengineering and Biotechnology上发表的综述文章全面系统综述了RNA干扰技术用于害虫防治的研究和应用进展，包括dsRNA的合成构建及大规模生产方式、外源施用途径、外源施用的dsRNA的命运、适用于dsRNA递送的纳米材料挖掘和应用以及RNA杀虫剂全球发展趋势等。

其他领域应用

RNA干扰技术在林业、畜牧业、渔业等领域进行良种培育和药物开发方面也具有巨大潜力。

在林业领域，可以利用RNA干扰技术培育抗病虫害的林木品种，提高林木的生长质量和产量。例如，通过干扰林木病原菌或害虫的关键基因，增强林木的抗性，减少病虫害的发生。

在畜牧业领域，可以利用RNA干扰技术培育优良的畜禽品种，提高畜禽的生产性能和抗病能力。例如，通过干扰畜禽致病基因的表达，降低畜禽的发病率，提高养殖效益。

在渔业领域，可以利用RNA干扰技术培育抗病虫害的水产养殖品种，提高水产品的产量和质量。例如，通过干扰水产病原菌或害虫的关键基因，增强水产品的抗性，减少病虫害的发生。

RNA干扰技术的未来展望

技术挑战与解决方案

RNA干扰技术虽然在多个领域展现出巨大潜力，但仍面临一些技术挑战。脱靶效应是其中之一，可能导致非目标基因的意外沉默，影响治疗效果和安全性。为解决这一问题，可以通过优化siRNA的序列设计，提高其与靶mRNA的特异性结合能力。例如，利用生物信息学工具对靶基因进行深入分析，筛选出具有高特异性的siRNA序列。同时，化学修饰也是一种有效的方法，如在siRNA的特定位置引入化学基团，可以增强其稳定性和靶向性，减少脱靶效应。

半衰期短也是RNA干扰技术的一个局限性。siRNA在体内容易被核酸酶降解，导致其作用时间较短。为延长siRNA的半衰期，可以采用载体递送技术，如脂质体、纳米颗粒等。这些载体可以保护siRNA免受核酸酶的降解，提高其在体内的稳定性和持久性。此外，还可以开发新型的RNA干扰分子，如环状RNA、长链非编码RNA等，这些分子具有更高的稳定性和更长的半衰期。

细胞毒性是另一个需要关注的问题。高浓度的siRNA可能对细胞产生毒性作用，影响细胞的正常功能。为降低细胞毒性，可以优化siRNA的浓度和给药方式，避免过高的浓度对细胞造成损伤。同时，也可以通过对细胞进行预处理，提高细胞对siRNA的耐受性。例如，使用低剂量的预处理剂，可以增强细胞的抗氧化能力，减少siRNA引起的氧化应激反应。

为了加速RNA干扰技术的研发，可以利用新技术，如人工智能和机器学习。这些技术可以帮助研究人员快速筛选出有效的siRNA序列，预测其在体内的作用效果，提高研发效率。此外，合成生物学技术也可以用于生产高效、低成本的siRNA，降低研发成本。