普鲁士蓝染色实验原理与操作步骤详解

普鲁士蓝染色实验原理与操作步骤详解

普鲁士蓝染色是一种常用的组织化学染色方法，主要用于显示局部组织内的含铁血黄素沉积。该染色方法具有稳定性好、可长期保存、不易产生沉淀、应用范围广等特点，可以很好地区分含铁血黄素和其他色素。

实验原理

亚铁氰化钾溶液使三价铁离子从蛋白质中被稀盐酸分离出来，三价铁与亚铁氰化钾反应，生成一种不溶解的蓝色化合物即三价铁的亚铁氰化物普鲁士蓝，所以该反应被称为普鲁士蓝反应。三价铁的亚铁氰化物是一种很稳定的化合物，在反应后可用红色染色剂进行复染，如核固红、伊红、中性红等。Perls stain 常用于显示局部组织内各种出血性病变，常见于吞噬细胞内。在判断含铁血黄素沉积时，用Perls 反应可以得到证实，该染色方法可以很好的区分含铁血黄素和其他色素。该染色液稳定性好、可以长期保存、不易产生沉淀、应用范围广、可以进行复染。普鲁士蓝染色过程包括三个基本步骤:

1. 用盐酸处理组织切片使血黄素分子的结合蛋白变性，从而释放铁(3+)离子。
2. 然后引入亚铁氰化钾。铁离子与这种溶液结合，形成一种不溶的亮蓝色颜料——即普鲁士蓝。虽然盐酸和亚铁氰化钾可以作为单独的溶液引入，但现在大多数配方通常将它们结合使用。

实验步骤

石蜡切片染色：

1. 组织固定于10%中性福尔马林，常规脱水包埋。
2. 切片厚度4μm，常规脱蜡至水。
3. 蒸馏水水洗1min。
4. 切片入Perls stain，浸染15～30min。
5. 蒸馏水充分冲洗5～10min。
6. 入核固红染色液，淡染细胞核15～30s。
7. 自来水冲洗1～5s。
8. 常规脱水透明，中性树胶封固

冰冻切片染色：

1. 无需脱蜡，直接迅速用蒸馏水冲洗2～3min。
2. 染色、脱蜡、透明、封固步骤同石蜡切片的染色步骤。

细胞染色：

1. 4%多聚甲醛固定10～20min
2. 自来水冲洗2次，每次2min。
3. 蒸馏水冲洗2次，每次2min。
4. 染色、脱蜡、透明、封固步骤同石蜡切片的染色步骤。

结果判读

铁血红素呈蓝色，细胞核呈红色。

注意事项

1. 切片脱蜡应尽量干净。组织固定常采用10%中性福尔马林，经普通福尔马林长期固定后，组织会有损伤。避免使用酸性固定剂，铬酸盐处理也会妨碍铁的保存。
2. 整个操作过程中容器要干净，避免用金属铁制品，洗切片和容器时以蒸馏水为宜，因普通水内含铁质。Perls stain染色时，应根据样本情况调整着色时间。
3. 所有切片都应使用同一个阳性对照切片，选择适合的对照非常重要。尸检肺组织是一个很好的对照，包含相当数量的铁阳性巨噬细胞(心衰细胞)。
4. 冰冻切片和细胞染色，最好根据具体情况摸索实验条件。

送检要求

备注： 每个样本仅保留唯一且清析可识的标记；邮寄前请与公司专业人员确认方法最佳；