一篇搞定WB蛋白定量(附BCA蛋白定量操作演示)

一篇搞定WB蛋白定量(附BCA蛋白定量操作演示)

Western Blot（WB）实验是生命科学研究中常用的技术手段，而蛋白定量是WB实验中的关键步骤之一。本文将详细介绍蛋白定量的重要性、常用方法及其优缺点，并提供具体的操作步骤和常见问题解决方案，帮助科研人员更好地完成WB实验。

为什么要进行蛋白定量？

WB实验需要对样品总蛋白进行定量，主要目的是对样品进行均一化处理，也就是使各个泳道蛋白总上样量一致。特别提醒这里的总上样量一致，是以质量单位上样（μg/孔）而不是以体积单位上样（μl/孔）。

举个例子

• 看下图目的蛋白表现出了表达量的差异性！

• 再看一下内参的表达量：

原来上样量不均一！图片中有些样品间表达水平差异没有意义。

• 再看下面一张图：

内参均一性非常好，这样才能说明目的蛋白的差异是有意义的。

• 另外还可以根据定量结果，优化上样总量，以得到更佳的结果。下图上样量太大，出现过曝反白。

蛋白定量有哪些方法？

蛋白质种类很多，结构、功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量的方法带来了许多困难。目前依据不同的原理，已经出现多种蛋白定量的方法。总蛋白定量的方法主要有Bradford法，BCA法，紫外分光光度法，lowry法等。今天主要讨论Bradford法和BCA法。

Bradford法 和 BCA法

BCA法和Bradford法均需制作标准曲线，需要注意：

1. 因为显色反应与温度和时间的变化有关，为了尽可能准确测定未知样品中的总蛋白浓度，建议每次进行分析时都应制作标准曲线。
2. 超出标曲范围内的数值无法确定，务必保证样品数据在标准曲线范围内。
3. 为了减小误差，建议做3个复孔。

怎么选择定量的方法？

要根据样品的组份，定量的区间，反应的时间，仪器设备等综合判断分析，选择最合适的方法。主要看样品中去垢剂，如果你的蛋白抽提试剂含有大量去垢剂，请选择BCA法。如果你的样品中含有EDTA等金属螯合剂(BCA法中Cu离子被螯合走)，或者含有还原性，建议选择Bradford法。

操作步骤

1. 计算并配置工作液；
2. 加入即用型标准品或梯度稀释的标准品，以及待测样品；
3. 加入BCA工作液。37℃孵育30min；
4. 测A562nm吸光值；
5. 制作标准曲线，并计算样品浓度。

绘制标准曲线 计算样品浓度

步骤一

观察测得OD值的每个复孔数值，是否有偏移较大的，如果有，去除该数值，或者去除这个检测点。

步骤二

计算平均值：计算各个浓度标准品以及样品OD值的平均值。

步骤三

输入标准品的对应的浓度，选中标准品OD值和标准品浓度，插入散点图。

步骤四

弹出一个图表，右击图表里面的散点，选择添加趋势曲线。

步骤五

右击趋势线，选择趋势线格式，选勾显示公式（E）以及显示R平方值。则在图表标题中显示出公式和R2值来。一般R2值越接近1代表你的标准曲线做得越好，根据标准曲线带入的样品OD值测出的蛋白浓度也越准确。R2值一般要求大于等于0.99。

步骤六

计算样品浓度。将样品OD值代入标准曲线的公式中，推导即得到待测样品蛋白的浓度。如果检测样品是稀释后的样品，则实际浓度需要乘以对应的稀释倍数。

常见问题：

1. 有小伙伴问，我提取细胞样本，可不可以通过细胞计数的方法代替蛋白定量？
   至少预实验的时候建议做蛋白定量。虽然蛋白定量主要目的是对样品进行均一化处理，保证上样量一致。但是另一个作用优化上样量，也十分重要。上样量太低，目标蛋白可能检测不到；上样量太高有可能导致过曝，灰度值分析误差大。有文献报道总蛋白上样量超过10ug/孔时内参蛋白不够敏感，无法检测到差异。内参蛋白理想的上样量5ug以内，目标蛋白的上样量为10-20ug。

2. 定量后，内参还是不齐？
   首先，蛋白定量环节：注意样品中是否含有干扰物质，选择适合的定量方法；检测的值是否在线性范围内；做复孔，减小误差。
   其次，转膜环节：注意转膜的均一。
   最后，注意内参蛋白的选择是否合适。比如GAPDH是常用的内参蛋白，但是GAPDH是糖酵解过程中的一个酶，在缺氧，糖酵解紊乱等情况会增加GAPDH在特定细胞中的表达。内参蛋白要选表达不受实验处理影响的蛋白。现在也有很多人用总蛋白作为内参，即通过考马斯亮蓝或者丽春红染总蛋白，伯乐推出stain-free免染胶，也可以准确反应每个泳道中的蛋白量，可以作为WB的可靠内参。

3. 样品间浓度差异大，如何调节浓度？
   样品提取时，组织样品可以通过称量，细胞样品可以通过计数，等比例加入提取液。这样各组样品浓度差异就不会非常大了。