Science. | 翻译组学技术助力揭示特定tRNA调控RNA降解的新机制

Science. | 翻译组学技术助力揭示特定tRNA调控RNA降解的新机制

CCR4-NOT复合物是真核mRNA稳定性的主要调节因子。翻译过程中的缓慢解码促进了CCR4-NOT与核糖体的关联，加速了mRNA的降解。本研究应用选择性核糖体分析来进一步研究哺乳动物细胞中CCR4-NOT向核糖体募集的决定因素。这表明P位点上的特定精氨酸密码子是CCR4-NOT亚基CNOT3的核糖体募集的强信号。冷冻电镜和tRNA诱变表明，精氨酸tRNA的D臂与CNOT3相互作用并促进其招募，而其他tRNA D臂与CNOT3存在空间阻抑。这些效应将密码子的内容与mRNA的稳定性联系起来。本研究表明tRNA除了典型的解码功能外，它们在翻译过程中还直接参与调节复合物，这种机制被称为P-site tRNA介导的mRNA衰变。

研究背景

CCR4-NOT复合物是真核mRNA稳定性的主要调节因子。翻译过程中的缓慢解码促进了CCR4-NOT与核糖体的关联，加速了mRNA的降解。本研究应用选择性核糖体分析来进一步研究哺乳动物细胞中CCR4-NOT向核糖体募集的决定因素。这表明P位点上的特定精氨酸密码子是CCR4-NOT亚基CNOT3的核糖体募集的强信号。冷冻电镜和tRNA诱变表明，精氨酸tRNA的D臂与CNOT3相互作用并促进其招募，而其他tRNA D臂与CNOT3存在空间阻抑。这些效应将密码子的内容与mRNA的稳定性联系起来。本研究表明tRNA除了典型的解码功能外，它们在翻译过程中还直接参与调节复合物，这种机制被称为P-site tRNA介导的mRNA衰变。

核糖体P位密码子是CNOT3募集到人类核糖体的主要决定因素

首先，作者采用Polysome profiling+WB分析了人CNOT3是否与翻译核糖体相关。结果显示CNOT3与人类细胞中的Polysome结合（图1A）。

同时，在蔗糖梯度分离之前，裂解物先用RNase处理，然后从所得的单体部分中免疫沉淀CNOT3（图1B-C）。CNOT3与单体共同沉积，并稳定地与大小核糖体亚基蛋白相关，说明CNOT3与核糖体直接结合。

随后，作者采用选择性核糖体分析（Ribosome profiling），以确定与CNOT3结合核糖体相关的mRNA的特征。通过RNase处理和蔗糖梯度分离制备单体，然后对CNOT3进行免疫沉淀（IP）（图1D）。核糖体足迹测序证实了开放阅读框架（ORF）内的三联体周期性（图1E）。

为了更广泛地探索密码子含量与CNOT3招募之间的可能联系，作者分析了核糖体P-和E-位点的密码子富集（图1F）。结果表明CNOT3结合核糖体中富集最多的密码子位于P位点。特别的是，精氨酸密码子（CGG、CGA和AGG）是富集程度最高的密码子。对CNOT3结合核糖体足迹编码的氨基酸的分析进一步证明了以精氨酸为中心的三肽的富集（图1G）。

总之，这些数据表明，P位点密码子与人类细胞中CNOT3共翻译招募密切相关，P位点上的精氨酸密码子为CNOT3结合提供了最强的可检测信号。

CGG、CGA和AGG精氨酸密码子促进CNOT3介导的mRNA衰变

P位富含CGG、CGA和AGG精氨酸密码子的mRNA与CNOT3结合并加速其降解。当CNOT3缺失时，这些富含特定精氨酸密码子的mRNA被优先稳定（T图2A-B）。

线粒体核糖体蛋白mRNA富集于CGG/CGA/AGG密码子中，受CNOT3调控

哪些受CNOT3最强烈调控的内源性mRNA呢？

分析显示含有线粒体核糖体蛋白的基因集在CNOT3缺失时高度上调（图2C）。为了确定这些影响是否与不稳定精氨酸密码子的富集有关，作者根据基因的加权CGG/CGA/AGG评分对基因进行排名。事实上，根据这一指标，含有线粒体核糖体蛋白的基因集是富集程度最高的基因集（图2D）。这些发现表明线粒体核糖体蛋白受CNOT3调控。

在HEK293T或Jurkat细胞中，CNOT3的缺失导致这些转录本的稳态丰度大幅增加（图2E-F），线粒体质量也相应增加（图2G-H）。此外，新生线粒体肽的荧光标记显示，线粒体翻译增加（图2I-J）。

因此，CCR4-NOT对线粒体核糖体蛋白（富含由CGG、CGA和AGG密码子编码的精氨酸）的调控会影响哺乳动物细胞中的线粒体稳态。

P位点精氨酸密码子-CNOT3的结构分析

为了研究P位精氨酸密码子如何促进CNOT3招募，作者构建了体外翻译系统。编码41个重复亮氨酸-精氨酸-天冬氨酸（LRD，其中精氨酸由CGG编码（41×LRCGGD））的mRNA的体外翻译，导致Flag标记的CNOT3大量招募到Polysome（图3A）。其他CCR4-NOT复合物组分也被选择性地招募到41×LRCGGD mRNA中（图3B）。CGG密码子能有效招募CNOT3（图3C）。

接着，作者采用Flag IP富集了积极翻译41×LRCGGD mRNA转录物的CNOT3结合核糖体的Polysome，并用冷冻电镜（cryo-EM）进行分析（图3D-J）。该模型为研究精氨酸密码子占据核糖体P位点时促进CNOT3募集的分子相互作用提供了结构基础。

P位点tRNA D臂是CNOT3翻译募集的关键决定因素

在人类细胞中，6个精氨酸密码子被5个不同的同受体tRNA家族解码（图4A）。所有精氨酸tRNA的d环是相同的。其中，tRNAArg，CCG和tRNAArg，UCG解码CNOT3结合核糖体（CGG和CGA）中最丰富的P位点密码子，它们之间除了保守的D环外，还具有相同的D-臂和反密码子茎序列（图4A-B）。精氨酸tRNA的D-臂和反密码子茎的变化可能会改变它们对CNOT3的亲和力。

接着，作者评估了tRNA序列特征和修饰在CNOT3募集中的作用，表明P位点tRNA的序列在共翻译CNOT3募集中起着关键作用，并且这种作用不依赖于特定的tRNA核苷酸修饰。最后基于结构模型，分析出含有U13:A22:A46三联体碱基相互作用的精氨酸tRNA可以增强CNOT3的募集。

同时，CNOT3与P位点tRNA的反密码子茎之间也存在相互作用。tRNA的反密码子茎变异也会影响CNOT3的招募效率。但作者发现U13:A22:A46三联体的存在是精氨酸tRNA招募CNOT3的主要决定因素，而反密码子茎的作用较小。

D-loop环GG基序上游的额外核苷酸阻止CNOT3的募集

以上结果表明：精氨酸tRNA具有促进CNOT3募集的独特序列和结构特征。那是否存在其他tRNA具有抑制CNOT3募集的特征呢？

作者检查了CNOT3结合核糖体P位点上缺失最多的密码子，发现对应的解码tRNA D环的α元件上有一个额外的核苷酸。而这个额外核苷酸会阻止CNOT3与tRNA的结合，删除这一额外核苷酸则可以显著提高CNOT3的招募效率。

因此，D-臂U13:A20:A46三联体和P位点tRNA中的短单核苷酸D-loop α元件是CNOT3共翻译招募的主要决定因素。

缓慢解码使P位点tRNA介导的CNOT3招募到核糖体

最后，作者发现当P位点被CGG、CGA或AGG精氨酸密码子占据时，A位点停留时间与CNOT3关联之间的相关性大大增强（图6A-B）。相反，当P位点存在任何其他密码子时，停留时间相关性无法检测到（图6C）。这些数据表明，缓慢解码增加了核糖体A和E位点同时空缺的可能性，为CNOT3进入E位点提供了机会。

研究结论

本研究阐释了这样一个模型：慢速解码使核糖体A位和E位空缺，为CNOT3进入E位并与P位tRNA相互作用创造条件。精氨酸tRNA的U13:A22:A46三联体促进CNOT3结合并加速mRNA降解，而D-loop中的额外核苷酸则抑制CNOT3结合，这表明tRNA不仅参与解码，还在mRNA降解中发挥作用。