如何用光看清植物健康：叶绿素荧光测定

如何用光看清植物健康：叶绿素荧光测定

叶绿素荧光测定是研究植物光合作用效率和健康状况的重要技术。通过检测植物叶片中的叶绿素分子在光照下所发出的荧光，可以深入了解植物的光合作用效率及其对环境胁迫的响应。本文将详细介绍叶绿素荧光测定的基本原理、方法、应用以及具体操作步骤。

什么是叶绿素荧光测定？

叶绿素荧光测定是通过检测植物叶片中的叶绿素分子在光照下所发出的荧光来研究植物光合作用效率和健康状况的技术。叶绿素是植物进行光合作用的关键色素，当光照射到叶绿素分子时，能量将主要用于光合作用、热耗散、和发射荧光。通过测定和分析荧光信号，人们可以深入了解植物的光合作用效率及其对环境胁迫的响应。

图1 植物叶绿素荧光参数成像示例图，包括Fm，Fo，Fo’ , FPSII, Fv, NPQ, qN, qP等。

测定叶绿素荧光的常见方法有哪些？

目前，测试叶绿素荧光测定分析有四种方法（分别是脉冲幅度调制荧光PAM、快速荧光动力学OJIP、快速重复率荧光FRR、日光诱导荧光SIF），PAM仍是目前最受欢迎和最具影响力的平台。在使用场景上，PAM适合于实验室环境，FRR方法也称为激光诱导叶绿素荧光瞬态，适合于野外连续监测，SIF可以利用光谱仪近地面测量或利用卫星遥感测量等。

叶绿素荧光的测定有哪些应用？

叶绿素荧光分析既是室内光合作用基础研究的先进工具，也是室外自然条件下诊断植物体内光合组织运转情况、分析植物对环境变化响应机制的重要方法。如今，人们通过叶绿素荧光分析估计量子效率、光合能力，计算光合电子传递效率、胞间CO2浓度，并试图用荧光参数来快速筛选遗传变异的植物。

叶绿素测定过程中常见的光源：

1. 测量光：是一种光强度极弱的调制光，几乎不能引起光系统II反应中心关闭，即全部QA都处于氧化态，此时荧光的产率最低，检测到的荧光参数为Fo。
2. 光化光（或作用光）：用于推动光合作用光化学反应，光强范围在0-2000 umol·m-2·s-1，可因实验目的不同而变化。
3. 饱和脉冲光：光强通常在5000-10000 umol·m-2·s-1，闪光时长≤1s，确保QA完全处于还原态（即QA-），此时测定的荧光参数为FM或FM’。
4. 远红光：720-730nm，PPFD为30 umol·m-2·s-1，4 s，测定Fo’之前使用，用于激发PSI而不激发光系统II，促使电子向下游传递，推动QA氧化。

测定叶绿素荧光的基本步骤是怎样的？

1. 暗适应：为了获得没有遭受任何环境胁迫的对照叶片的基本荧光参数，测定前要让叶片经过一个充分的暗适应过程，最好过夜。
2. 给完成暗适应的叶片照射检测光，经1-2 min，叶片发射的叶绿素荧光水平稳定后，得到荧光参数Fo。
3. 给叶光照射饱和脉冲光（10000 umol·m-2·s-1，1s），一个光脉冲后得到荧光参数FM。
4. 计算可变荧光和PSII最大的或潜在的光化学效率Fv/FM。
   Fv/FM=（FM-Fo）/FM
5. 给叶片照射光化光（能够推动光合作用进行但不能使光合作用饱和的光），光强一般为几百 umol·m-2·s-1，光强可因植物生长条件或实验目的不同而变化。经过几分钟到几十分钟，叶片光合作用达到稳态，得到荧光参数Fs。
6. 再给叶片照射饱和脉冲光，一个光脉冲后关闭饱和脉冲光，得到荧光参数FM’。
7. 计算作用光存在时光合机构PSII实际的光化学效率 φPSII。
   φPSII=（FM’-Fs）/FM’=ΔF/FM’
   φPSII可用于计算PSII或非循环电子传递速率ETRPSII。
8. 计算叶绿素荧光的非光化学猝灭系数NPQ，
   NPQ=（FM-FM’）/FM’=FM/FM’-1
9. 在关闭饱和脉冲光之后不久（约1 min）再关闭作用光，并立即给叶片照射远红外光，这时得到荧光参数Fo’。
10. 计算叶绿素荧光的光化学猝灭系数qP，
    qP=（FM-FS）/（FM’-Fo’）

叶绿素测定过程中需注意的问题

1. 测定温度：在20 ℃以下的环境中测定时，由于荧光仪探头和叶片之间的温度差会引起探头表面凝水，造成低估qP值。
2. 叶绿体运动：光引起的叶绿体运动会导致高估qN，防止办法是从作用光中除掉能引起叶绿体运动的光（波长<510 nm）。
3. 叶片表面特征：叶片上下表面的特征不同，导致Fv/FM也不相同。
4. 暗适应时间的确定取决于实验目的。如果要得到PSII最大的光化学效率Fv/FM，那最好经过一个黑暗的夜晚，使所有的能量耗散过程全部停止；如果要连续观察荧光参数的日变化等动态变化，则15-20 min的黑暗即可。
5. 荧光参数预期值：

• Fv/FM（C3、C4植物和藻类分别为0.83-0.85、0.78和0.70）
• φPSII（小于Fv/FM的任何值）
• NPQ（一般0-4）
  这些数据可以作为测定结果是否可靠的参考。

6. 用荧光参数 φPSII计算的光合电子传递效率ETRPSII只是一个近似值，可能有多种误差来源。例如，ETRPSII计算式中的0.84（叶片光吸收的百分数）和0.5（两个光系统均等地使用叶片吸收的光能）都是假设的，未必符合被测叶片的真实情况，除非通过试验测定这两个数值。
7. 不可在同一叶片的同一部位过多、过频地（即两个光脉冲之间的暗间隔过短）使用饱和光脉冲，否则会导致光合机构的光破坏。
8. 叶片荧光测定不可代替气体交换测定。尽管用叶绿素荧光参数计算光合电子传递速率可以估计光合能力，但仍不能代替气体交换测定。即使同一时刻在叶片的同一部位测定，荧光分析结果和气体交换结果也多有不同。例如，荧光测定一般反映叶片上层细胞的情况，而气体交换测定则反映整个叶片包括中下层细胞的情况。再如，PSII最大的光化学效率Fv/FM对水分胁迫不是很敏感，即使叶片的相对含水量降到50%以下，也很少变化，但此时气体交换测定的光合速率已急剧降低。因此，若想对叶片的光合功能做出正确估计，最好将这两种甚至更多的技术同时使用。