牛肉宰后成熟过程中细胞自噬的变化分析
牛肉宰后成熟过程中细胞自噬的变化分析
我国作为仅次于美国和巴西的第三大牛肉生产国，肉牛产业已成为的重要产业之一。动物屠宰后，肌肉组织与外界环境的物质及能量交换被切断，缺氧、缺血、代谢物积累等导致肌肉组织在短期内发生大量生化反应并对牛肉品质调控起到关键作用。
细胞自噬作为细胞程序性死亡的主要方式之一，在面对缺血缺氧环境的胁迫时，会发生相应的表达上调，以维持细胞在应激环境下的生存。AMPK-mTOR-ULK1通路作为细胞抵御外界氧化应激的重要通路，也是触发细胞自噬的重要通路之一，在宰后肌肉缺血缺氧的状态下，可以磷酸化激活AMP活化蛋白激酶（AMPK），活化后的AMPK可以通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），减少mTOR经由Ser757位点的磷酸化对酵母Atg1同源蛋白激酶（ULK1）的抑制作用，从而诱导细胞自噬的发生，以维持机体内环境稳态，但该通路中的关键信号分子在宰后牛肉成熟过程中的变化规律仍未得到深入研究。
山东农业大学食品科学与工程学院的李叶、鲁文洁、朱立贤等对细胞自噬相关蛋白Beclin-1、微管相关蛋白1轻链3（LC3）和AMPK-mTOR-ULK1信号通路中相关蛋白的变化规律及其对牛肉肉色、保水性、嫩度等品质指标的影响进行分析，以期阐明宰后细胞自噬对牛肉品质的影响，为宰后肌肉成熟嫩化机制研究提供新视角。
宰后成熟过程中的肉色变化
肉色是评定牛肉品质的重要指标之一，与肌红蛋白含量和水分含量有很大的关系。
L
值表示牛肉的亮度，如表1所示，成熟时间对
L
值影响显著（
P
＜0.05），随成熟时间的延长，
L
值呈现上升趋势并在14 d达到最大值，表明牛肉宰后成熟过程中亮度持续升高，这可能是由于宰后成熟过程中pH值逐渐靠近等电点，肌球蛋白和肌动球蛋白等蛋白质发生收缩和凝固而成为颗粒，使得游离水增加，导致系水力下降，渗出到肉表面的水分增多，使肉色发亮；成熟过程中
a
值呈先升高后下降的趋势（
P
＜0.05），并在3 d达到最大值，原因在于宰后初期肌红蛋白与氧气结合形成鲜红色的氧合肌红蛋白，使得
a
值逐渐增大，随着成熟时间的进一步延长，氧合肌红蛋白进一步与氧气结合生成暗褐色的高铁肌红蛋白，导致
a
值不断下降；与
a
值变化趋势相似，
b
值也呈先升高后降低的趋势（
P
＜0.05），并在3 d达到最大值，宰后成熟时间的延长使得肌肉与氧气充分接触，肌内脂肪被氧化，从而导致
b
值增大。
宰后成熟过程中剪切力的变化
剪切力可以反映宰后成熟过程中肌肉的嫩度。由图1可知，在整个成熟过程中，剪切力在宰后2～3 d显著降低（
P
＜0.05），此后随着成熟时间的延长呈现下降的趋势，但并无显著变化（
P
＞0.05），14 d达到最小值。刘吉娟 通过透射电镜观察发现，随成熟时间的延长，肌纤维的结构被内源酶破坏，排列较为松散，Z线结构开始模糊，肌原纤维断裂程度逐渐加重，肌原纤维之间产生较大的缝隙，导致肌纤维小片化加剧，从而使得肌肉嫩度增大、剪切力降低 。
宰后成熟过程中的Desmin蛋白相对表达量变化
Desmin降解是肉嫩化的标志之一，是牛肉宰后嫩化的必要过程。宰后牛肉成熟过程中，Desmin蛋白相对表达量变化如图2所示，随着宰后成熟时间延长，Desmin蛋白相对表达量逐渐降低，其降解程度随宰后成熟时间的延长不断增加（
P
＜0.05）。Lonergan等 发现Desmin的降解会导致肌纤维小片化加剧并破坏细胞结构，使剪切力降低，这与本研究所测2 d剪切力的结果基本一致。同时研究表明，肌间线蛋白的降解对肉成熟过程中的系水力具有重要的意义，其降解对肉的嫩度具有改善作用 。因此，Desmin降解程度增大，剪切力降低，牛肉的嫩度得到改善 。
宰后成熟过程中的保水性变化
保水性是影响宰后牛肉品质的关键因素，较少的贮藏损失和蒸煮损失在一定程度上可以表征牛肉良好的保水性。如表2所示，牛肉宰后成熟期间的贮藏损失率与蒸煮损失率均随成熟时间的延长发生显著变化（
P
＜0.05）。牛肉宰后成熟过程中的蒸煮损失呈现先下降后升高的趋势，在第2～3天发生显著下降，可能是由于宰后成熟的前2 d，牛肉处于僵直状态，组织中的自由水不断外渗，宰后第2天到达最大僵直期，此时宰后牛肉的保水性最差，之后牛肉进入解僵期，肌肉回软，保水性开始恢复 。随着贮藏时间的不断延长，肌纤维和细胞骨架蛋白会发生不同程度的降解，使得肌纤维和细胞膜之间的联系丧失，导致蒸煮损失再次出现增大的趋势 。宰后成熟过程中，贮藏损失率随着成熟时间的延长呈上升的趋势（
P
＜0.05）。刘吉娟 研究发现，宰后ATP含量的下降促使肌动球蛋白形成，引起肌肉僵直收缩，肌丝的空间结构被缩小，导致水分被挤出，引起贮藏损失增加。与此同时，宰后成熟过程中蛋白质的氧化会导致肌原纤维骨架蛋白的主链断裂，肌肉纤维结构遭到破坏，肌纤维间隙增加，导致肌纤维持水流出，肌肉水分损失增大 。
宰后成熟过程中自噬相关蛋白表达变化
自噬标志蛋白Beclin-1、LC3表达变化
Beclin-1是一种参与自噬启动的关键蛋白，其表达量在一定程度上反映了自噬水平。LC3是酵母Atg8的同源物，与哺乳动物体内自噬体泡的数量呈正比，LC3-I向LC3-II的转化被看作自噬激活的标志。因此，LC3-II/LC3-I的比值增大和Beclin-1的蛋白相对表达量上调可以视作自噬激活的有力标志。如图3所示，宰后成熟过程中，Beclin-1蛋白相对表达量与LC3-II/LC3-I比值均呈现先升高后降低的趋势，在宰后12 h达到最大值，24 h后显著下降（
P
＜0.05），二者趋势基本一致。
细胞自噬是肌肉细胞对抗诱导性刺激的一种适应性策略，宰前应激会引发细胞自噬，使得自噬在肌肉组织中较早激活 。同时，自噬作为一种高度保守的分解代谢和能量生成过程，对促进细胞内物质和受损细胞器的降解发挥着重要作用 。屠宰过程使得牛肌肉细胞处于代谢应激状态，会对宰后的肉质产生重要影响 ，自噬的激活对于短期内维持屠宰后的细胞活力至关重要 。
AMPK-mTOR-ULK1通路相关蛋白表达变化
AMPK-mTOR-ULK1通路在自噬诱导过程中具有重要的调节作用。AMPK是一种关键的细胞内能量传感器，可以通过AMP/ATP的比率增加而激活，并且可以直接使许多代谢酶磷酸化。其在骨骼肌的葡萄糖摄取、糖原合成和脂肪氧化中均发挥着重要作用。AMPK一旦被激活，就会通过磷酸化多种途径中的关键蛋白（包括mTOR复合物1等）将新陈代谢重新导向为分解代谢增加和合成代谢减少的方向。如图4a～d所示，随着宰后成熟时间的延长，AMPK、p-AMPKThr172的蛋白相对表达量及p-AMPKThr172/AMPK比值均呈现先升高后降低的趋势，在12 h达到最高水平，12 h后显著下降（
P
＜0.05）。
ULK1复合体是自噬通路的核心调控蛋白，是自噬形成的早期阶段所必需的。如图4e所示，在宰后成熟过程中，ULK1蛋白相对表达量呈现先增加后减少的趋势，宰后0.75～12 h，ULK1的蛋白相对表达量持续升高，并在宰后12 h AMPK活性最强时达到最大值。Kim等研究证明，活化的AMPK还可以直接磷酸化ULK1上的Ser317位点和Ser777位点，激活ULK1，诱导细胞自噬的发生。
mTOR是一种整合生长因子和营养信号的中央细胞生长调节因子，也是能量状态感受器，在自噬过程中通过调节ULK1的Ser757位点磷酸化对自噬的发生过程起负调节作用。如图4f所示，宰后成熟过程中，mTOR蛋白相对表达量随宰后成熟时间的延长持续下降，在宰后12 h，AMPK活性较高的同时mTOR蛋白相对表达量发生显著下降（
P
＜0.05）。研究表明，当能量消耗导致ATP含量下降时，AMPK被激活并通过直接磷酸化mTOR，抑制mTOR的活性。
自噬相关蛋白表达与宰后牛肉品质指标间的相关性分析
为了进一步探究宰后成熟过程中细胞自噬的发生与宰后牛肉品质之间的关系，本研究对牛肉宰后成熟过程中自噬相关蛋白表达量和主要品质指标进行了相关性分析。如表3所示，在宰后成熟过程中，肉色方面
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值与Beclin-1蛋白相对表达量呈负相关，
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值与LC3-II/LC3-I呈负相关，
b
值与ULK1的蛋白相对表达量呈负相关；保水性中蒸煮损失与Beclin-1蛋白相对表达量呈正相关；嫩度方面，剪切力与ULK1蛋白相对表达量呈正相关，Desmin蛋白相对表达量与AMPK蛋白相对表达量呈负相关，这说明宰后成熟过程中细胞自噬的发生与宰后牛肉品质变化密不可分。García-Macía等通过对不同品种的牛进行实验后，首次提出宰后早期（24 h内）自噬的发生伴随组织蛋白酶（组织蛋白酶B、组织蛋白酶D）活性的增强，并通过进一步研究发现，自噬的发生能够延迟Z盘的解体、肌节横向排列的丧失和肌纤维的纵向分裂，从而影响肌肉破坏和肉的嫩化。Nakanishi等通过对小鼠宰前注射自噬抑制剂渥曼青霉素，发现小鼠宰后骨骼肌LC3-II/LC3-I比率与肌肉蛋白质的含量变化之间存在高度相关性，宰前的饥饿处理诱导自噬的表达上调并加速小鼠骨骼肌蛋白质的变化。为明确宰后细胞自噬与肌肉嫩化间的具体联系，贾旭以奶山羊为研究对象，分别用自噬激活剂雷帕霉素和抑制剂3-甲基腺嘌呤处理，发现自噬的激活促使肌原纤维降解、肌间线蛋白表达量上调。薛盼盼对猪的宰后成熟过程进行研究，发现其宰后成熟过程中细胞自噬相关蛋白LC3-II/LC3-I的相对表达量与保水性呈正相关、自噬蛋白5表达量与剪切力呈正相关，共同促进宰后成熟过程中猪肉的嫩化。此后，Wang Tongting等用槲皮素处理宰后成熟过程中的鸡肉，发现槲皮素通过调节Akt/mTOR通路启动了诱导细胞凋亡并增强自噬的过程，使得LC3-II/LC3-I的蛋白相对表达量上调、肌原纤维中A带和M带发生明显降解，并对肌肉嫩度起到一定的改善作用。但Lana等则认为屠宰前阶段ATP的减少理论上可能会阻碍肌肉细胞的防御能力，避免自噬行为，从而通过凋亡迅速达到嫩化。本研究结果表明，牛肉宰后成熟过程中细胞自噬的表达水平会对宰后牛肉品质产生一定程度的影响，宰后成熟过程中，自噬相关蛋白表达变化与牛肉的肉色变化呈负相关，与蒸煮损失、剪切力、Desmin蛋白相对表达量变化呈正相关，但细胞自噬对宰后牛肉嫩化的具体调控机制仍有待进一步探究。
结论
牛肉宰后成熟过程中，细胞自噬主要发生在宰后初期，自噬标志蛋白LC3-II/LC3-I与Beclin-1蛋白相对表达量较高，表明宰后牛肉在面对屠宰放血带来的缺氧环境胁迫时，为维持细胞内环境稳态，响应细胞自我防御机制的细胞自噬发生表达上调。肌糖原分解代谢造成AMP/ATP的比率增加进而激活AMPK，启动AMPK-mTORULK1通路。研究表明，AMPK、ULK1表达量在宰后12 h达到最高，随着宰后成熟时间的延长，牛肉保水性下降，剪切力与Desmin蛋白相对表达量降低，表明宰后细胞自噬影响了宰后牛肉的嫩化。综上，宰后牛肉成熟过程中发生了细胞自噬，进而影响了牛肉的品质。由于宰后牛肉嫩化与细胞自噬间的具体调控机制错综复杂，接下来将通过用激活剂和抑制剂对宰后牛肉进行处理，进一步探究宰后牛肉成熟过程中细胞自噬调控宰后牛肉品质的机制。
本文《牛肉宰后成熟过程中细胞自噬的变化分析》来源于《食品科学》2024年45卷第15期214-221页，作者：李 叶，鲁文洁，王海蓉，杨啸吟，刘昀阁，梁荣蓉，毛衍伟，张一敏，朱立贤。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240109-093。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑；云南师范大学生命科学学院 母朵银；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。