细胞凋亡检测十八法

细胞凋亡检测十八法

细胞凋亡是生物体维持正常生理功能的重要机制，其检测方法对于生命科学研究具有重要意义。本文系统介绍了细胞凋亡的多种检测方法，包括膜渗透性检测、线粒体损伤检测、Caspase活性检测、P53活性检测以及DNA片段化检测等，为相关领域的研究人员提供了详实的参考。

膜渗透性/损伤检测

Annexin V结合实验

Annexin V结合实验是鉴定和定量分析凋亡细胞的常用技术手段。Annexin V是一种钙离子依赖性的磷脂结合蛋白，对磷脂酰丝氨酸（PS）具有高亲和力。在健康细胞中，PS位于细胞膜的内侧，而在细胞凋亡过程中，PS会从内侧翻转至细胞膜外侧，从而可与Annexin V发生特异性结合。在实验应用中，Annexin V常与7-ADD或碘化丙啶（PI）联合使用，这种组合可以在一定程度上区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。

乳酸脱氢酶测定

乳酸脱氢酶（LDH）在细胞膜通透性增加或细胞膜受损时，会释放至细胞外。乳酸脱氢酶是一种广泛存在于所有活细胞中的胞质酶，当细胞因坏死性凋亡或细胞焦亡而受损时，LDH会释放到细胞外环境中。在细胞焦亡过程中，激活的caspase-1裂解gasdermin D，后者释放其N末端成孔结构域，该结构域插入质膜，导致细胞质内容物释放，包括LDH等。

乳酸脱氢酶有五种不同的同工酶，但它们均催化相同的反应，即将NAD⁺还原为NADH和H⁺，同时将乳酸氧化为丙酮酸。乳酸脱氢酶测定可用于评估细胞活力和细胞增殖情况，该方法具有操作简便、快速、准确的特点。乳酸脱氢酶测定可采用比色法或荧光法。在比色法中，在NADH和H⁺存在下，白色TTC转化为红色TPF，通过测量492nm处的吸光度，其值与受损细胞数量成正比。LDH的荧光测定基于非荧光性resazurin转化为荧光性resorufin。LDH检测能够检测到细胞膜的低水平损伤，且不会对健康细胞群造成损害，可直接在细胞培养孔中进行。

线粒体损伤检测

MTT 和 XTT 检测

MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物）和 XTT（2,3-双-（2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基）-2H-四唑-5-甲酰苯胺）属于四唑盐类化合物，与 TTC 不同，MTT 和 XTT 主要用于检测细胞活力以及评估药物或化合物的细胞毒性。TTC 仅能进入受损细胞，而 MTT 和 XTT 在细胞内分别形成不溶性和可溶性甲瓒产物。MTT 呈黄色，在线粒体琥珀酸脱氢酶的作用下，被还原为紫色甲瓒晶体，这一过程反映了线粒体的功能活性。紫色甲瓒的生成是活细胞活跃代谢的标志，通过特定试剂溶解后，溶液颜色的深浅与代谢活性细胞的数量呈正相关。

MTT测定已被广泛应用于细胞活力评估和药物毒性检测，被视为该领域的金标准。然而，研究已证实MTT测定存在非特异性问题，在多种实验条件下结果可能出现不一致性。XTT是MTT的改良替代品，作为一种对氧化还原电位敏感的四唑化合物，在有主动呼吸的细胞存在时，可将水溶性底物转化为橙色甲瓒产物。

线粒体膜电位检测

线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP），用符号Δψm表示，其丧失可能并非细胞死亡的早期标志，而是死亡信号通路的结果。线粒体通透性过渡孔的开启可诱导跨膜电位去极化、促使AIF（细胞凋亡诱导因子）等凋亡因子释放以及导致氧化磷酸化功能丧失。细胞色素c的释放可能不依赖于MMP，但AIF的释放则依赖。线粒体通透性过渡孔（PTP）是一种大型通道，是多种凋亡因子释放的来源，也是线粒体跨膜电位（TMP）变化的原因。为了检测MMP和TMP，有多种膜渗透性亲脂性和阳离子荧光染料可供选择，例如DiOC6 (3)（3,3'-二乙基氧杂羰花青碘）、罗丹明-123（Rh123）、四甲基罗丹明甲酯（TMRM）或相关TMRE（四甲基罗丹明乙酯）、JC-1和胺（CMX-Ros等）。所有这些染料均可用于荧光显微镜的定性观察，或通过流式细胞术或荧光酶标仪进行定量检测。当细胞凋亡启动且细胞状态不佳时，线粒体外膜失去其电化学梯度，阳离子染料开始扩散至细胞质并发出荧光（通常为绿色），这与线粒体功能正常时染料在线粒体中聚集的形式（通常为红色）不同。

链球菌溶血素O通透细胞测定

线粒体的关键生理功能在于通过三磷酸腺苷（ATP）的氧化磷酸化产生能量，氧气在这一过程中用于促进线粒体呼吸。线粒体呼吸的作用是在线粒体内膜上产生质子梯度，该质子梯度也被称为线粒体跨膜的电位梯度，进而驱动诸多线粒体功能，包括ATP合成、钙和其他离子交换剂的转运以及蛋白质的输入。线粒体的其他功能涉及活性氧（ROS）的产生与解毒、细胞凋亡的参与、代谢物的合成与分解代谢以及细胞质和线粒体基质的调控。在线粒体生物能量学中，质子回路占据核心地位，因此线粒体膜能力的提升对ATP合成具有直接影响。将细胞置于冰上并用链球菌溶血素O进行处理，是一种用于测量线粒体ATP合成的简便方法，其原理在于使质膜具有通透性，同时不损害线粒体功能，该检测方法被称为链球菌溶血素O通透细胞的线粒体活性（MASC）测定。MASC测定主要用于检测因细胞功能障碍而导致的线粒体ATP合成损失。具体操作步骤为：将细胞置于微孔板中并暴露于链球菌溶血素，随后洗涤以去除多余的链球菌溶血素O，再将温度升至37°C。在加入腺苷酸激酶抑制剂Ap5A之后，通过补充ADP（作为呼吸链和荧光素/荧光素酶的底物）来启动反应。需要注意的是，MASC测定对细胞凋亡的检测并不具有特异性，因为它仅能反映线粒体ATP合成的丢失情况，而此时细胞凋亡或死亡并非唯一的影响因素。

细胞色素c释放检测

在细胞凋亡过程中，细胞色素c会从线粒体易位至胞质溶胶，并与APAF1发生相互作用，进而募集Caspase9，形成包含细胞色素c、APAF1和Caspase9的多蛋白复合物，即凋亡体。细胞色素c从线粒体向胞质的易位是关键环节，它能够激活Caspase的级联反应，从而引发程序性细胞死亡，即细胞凋亡。相反，当细胞受到损伤时，细胞色素c可在细胞外空间释放，并可能作为DAMP发挥作用，触发炎症反应。细胞色素c的不适当易位决定了其抗炎或促炎特性。在心肌梗死、复苏及心脏骤停等情况下，细胞色素c会释放到血液循环中。在这些事件中，细胞死亡并释放的细胞色素c与血液循环混合，可作为线粒体损伤和器官损伤的标志物。在伴有全身炎症反应和多器官功能障碍综合征的患者体内，血清中细胞色素c水平更高。检测细胞色素c的释放具有重要意义，目前有多种检测技术，如流式细胞术、ELISA、HPLC、分光光度法和蛋白质印迹法。以流式细胞术为例，其操作步骤为：将培养的细胞固定，并与抗细胞色素c单克隆抗体一起孵育过夜，随后用封闭缓冲液洗涤。通过与完整线粒体的荧光进行对比，其峰/荧光相对较小。该技术为检测细胞凋亡期间细胞色素c的释放提供了有效手段。

Caspase活性检测

ELISA

活化的Caspase作为程序性细胞死亡的生物标志物之一。细胞角蛋白18（CK18）是一种能够被Caspase裂解的蛋白质，在细胞凋亡进程中，CK18可被激活的Caspase 3、7 和 9 靶向，进而快速裂解，以促进凋亡小体的形成。M30和M65 ELISA通过测定M30：M65比值，作为一种常用的凋亡检测手段。（M30: caspase-cleaved CK18 (M30) ，M65：Total CK18）。

荧光和比色测定

蛋白酶半胱天冬酶家族 [如白细胞介素-1β转换酶 （ICE）/细胞死亡蛋白-3（CED-3）等] 已被确定为细胞凋亡的关键参与者。人半胱天冬酶家族由 10 种蛋白酶组成，包括半胱天冬酶 1-10，它们均具备在天冬氨酸残基后裂解底物的能力。Caspase-3 被视为细胞凋亡的介质，活性 caspase-3 可切割PARP（一种参与 DNA 修复、基因组完整性和监测的酶），caspase-3 对 PARP 的切割出现在细胞凋亡初始阶段，抑制 PARP 切割能够降低细胞凋亡程度。caspase-3 的活性可以通过带有荧光标记的四肽 DEVD（由 Asp-Glu-Val-Asp 组成的不同氨基酸序列）来进行检测。

免疫组化

通过抗体（caspase-3 或 9 抗体等），在组织原位使用免疫组化的方法进行检测。

流式细胞术

联合运用RIP3抗体（坏死细胞的标志物）与Caspase3抗体（凋亡标志物），能够区分处于不同状态的细胞。

质谱方法

自组装单分子层用于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 （SAMDI-MS），其亦可用于研究半胱天冬酶活性和细胞凋亡。

P53活性检测方法

p53作为一种核磷蛋白，通过诱导细胞凋亡或介导细胞周期在G1期的阻滞，在细胞应对DNA损伤修复的过程中发挥关键作用。

FASAY

酵母功能诊断法（FASAY）是一种以酵母为基础的功能检测手段，用于检测转录活性，这是野生型p53肿瘤抑制活性的基础性功能。

FASAY是一种比色检测手段，对p53突变的检测具有高度敏感性、半定量特征及特异性。在该检测中，野生型p53对应的为白色菌落，而突变体p53则对应红色菌落。

p53蛋白分析方法

WB、免疫组织化学和ELISA是p53 蛋白测定常用方法，不做赘述。

DNA片段化检测

DNA片段化是由于半胱天冬酶级联反应的激活而发生的，是程序性细胞死亡的主要生化标志之一。

APO ssDNA检测

通过应用针对单链DNA（ssDNA）的抗体来识别凋亡细胞中受损的DNA。该检测方法的核心原理是在凋亡细胞中采用甲酰胺（一种仅在凋亡细胞中使DNA变性的温和试剂）对DNA进行选择性变性，并利用ssDNA单克隆抗体检测变性后的DNA。该检测的特异性源于凋亡染色质中DNA浓缩，在甲酰胺存在的情况下对热变性高度敏感，这足以在低温条件下产生大量的ssDNA。

TUNEL法

DNA片段化至180-200 bp和超过50 kbp是明确区分细胞凋亡的特征性表现。TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的d-UTP缺口末端标记）通过用荧光染料标记原位检测DNA链断裂。TUNEL测定借助荧光、细胞术和显微镜法识别和定量凋亡和坏死性凋亡细胞，作为一种经典的检测手段，目前有多种市售试剂盒可供选择。

ISEL

原位末端转移酶标记技术（ISEL）是TUNEL检测方法的一种改良形式。该技术涵盖对DNA的游离端实施放射性及非放射性标记。ISEL以DNA聚合酶1或其Kelnow片段的活性为基础，该聚合酶利用断裂的DNA链的3'末端，填充洋地黄毒素标记或生物素化的核苷酸底物，将其作为原位模板来合成新的DNA片段。经过组织化学处理后，可通过显微镜观察，也可借助流式细胞术进行检测。ISEL技术对凋亡细胞和坏死细胞均呈阳性反应。

ELISA

核酸内切酶的激活产生核小体DNA，其作为细胞凋亡的生化标志。DNA片段化会释放组蛋白（包括H1、H2A、H2B、H3和H4），这些组蛋白可通过ELISA法进行检测。核小体ELISA作为一种DNA片段化检测方法，具有较高的灵敏性，但并非细胞凋亡特异性。

基于凝胶电泳的方法

DNA ladder

细胞凋亡过程中，DNA片段化分为两个阶段。DNA依次降解。第一阶段产生50–300kbps的DNA片段。第二阶段则产生180-200bps的片段。DNA ladder是一种简便且易于操作的检测片段化DNA的方法。

单细胞凝胶电泳（SCGE）

单细胞凝胶电泳（SCGE）是一种微电泳检测手段，用于检测由辐射或热疗引发的DNA片段化，有助于在单细胞层面实现DNA损伤的可视化。将受损细胞悬浮于熔融琼脂糖凝胶中，在中性洗涤剂中进行裂解，随后将其投射至显微镜载玻片上。在5V/cm的电场下运行5分钟，之后采用荧光染料进行染色。该方法也被称为彗星测定法，因DNA在电泳图上的迁移模式形似彗星而得名。