文献速递 | 选择性识别细菌磷脂PG的抗菌肽设计

文献速递 | 选择性识别细菌磷脂PG的抗菌肽设计

近年来，随着抗生素耐药性问题日益严重，抗菌肽作为一类新型抗菌药物备受关注。华南理工大学等机构的研究团队在《Science Advances》发表了一项重要研究成果，他们设计了一类能高选择性识别细菌磷脂PG的放射状两亲性抗菌聚肽（RAPs），并揭示了其作用机制。这一发现为开发具有高度细菌选择性的抗菌肽提供了新的思路和方法。

研究表明，抗菌肽与传统抗生素相比展现出独特的杀菌机制，即直接物理破坏细菌的细胞膜。这一机制赋予了抗菌肽广谱且高效的杀菌能力，包括对耐药细菌的有效杀伤；同时相较于传统抗生素，它们不易诱发细菌的耐药性，因此在对抗耐药细菌方面显示出巨大的潜力。然而，抗菌肽对哺乳动物细胞具有较强的毒副作用，目前临床应用主要局限于局部给药，例如用于皮肤、鼻腔和口腔等。因此，提高抗菌肽的细菌选择性并降低对正常组织细胞的毒性，是新型抗菌肽研发中亟待解决的关键问题。

在传统观念中，抗菌肽主要通过无明确靶点的非特异性电荷和疏水相互作用机制来破坏细菌细胞膜，从而发挥抗菌作用。抗菌肽通常具有由阳离子和疏水氨基酸组成的正电两亲性结构，首先通过静电相互作用结合到带强负电的细菌细胞膜表面，随后其疏水结构通过疏水相互作用插入磷脂双分子层，破坏细菌细胞膜的完整性，杀伤细菌。基于这一机制，研究人员专注于调节抗菌肽的两亲性结构，增强与细菌细胞膜的电荷和疏水相互作用，同时尽量减少与哺乳动物细胞膜的相互作用，从而提高细菌选择性。然而，哺乳动物细胞膜中也含有一定比例的负电性磷脂，主要为磷脂酰丝氨酸（PS，约占15%），与抗菌肽可发生较强的电荷相互作用；且哺乳动物细胞膜磷脂双分子层的疏水尾链区同样也会与抗菌肽的疏水区域发生强的疏水相互作用。因此，在基于传统非特异性静电和疏水相互作用的抗菌模式下，如何避免抗菌肽对哺乳动物细胞的潜在毒性是极大挑战。

细菌细胞膜含有大量阴离子磷脂PG和两性磷脂酰乙醇胺（PE）；哺乳动物细胞膜含有两性磷脂酰乙醇胺（PE）、两性磷脂酰胆碱（PC）、鞘磷脂（SM）以及阴离子磷脂PS。相比于哺乳动物细胞膜，细菌细胞膜存在磷脂酰甘油PG，该特异性磷脂在增强膜稳定性、调节磷脂的脂质堆积和酰基链排列以及调节膜渗透性方面起着关键作用。因此，细菌特异性磷脂PG有望成为抗菌药物设计的目标。然而，如何区分PG和哺乳动物细胞主要负电性磷脂-磷脂酰丝氨酸PS是关键挑战。

近期，华南理工大学生物医学科学与工程学院、国家人体组织功能重建工程技术研究中心熊梦华教授团队，与中国科学技术大学肖石燕副教授、中山大学孙逸仙纪念医院鲍燕研究员、松山湖材料实验室元冰研究员及华南理工大学软物质科学与技术高等研究院董学会教授合作，在《Science Advances》杂志发表了一题为“Helicity-directed recognition of bacterial phospholipid via radially amphiphilic antimicrobial peptides”的研究论文。该论文报道了一类放射状两亲性抗菌聚肽，能高选择性地识别细菌磷脂PG，并证明了螺旋结构在抗菌聚肽识别细菌磷脂中起了关键作用，为开发具有高度细菌选择性的抗菌肽引入了靶向细菌特异性磷脂的模式。

作者研究发现，一类具有螺旋结构的径向两亲性抗菌聚肽（radially amphiphilic antimicrobial peptides, RAPs）对细菌负电性磷脂PG的作用显著强于哺乳动物细胞负电性磷脂PS（图1）。通过等温量热滴定仪分析不同疏水性季胺官能化的螺旋结构RAPs和不同磷脂之间的相互作用，结果显示RAPs与PG之间的相互作用显著强于PS，而与PC、SM、PE等两性磷脂无明显相互作用。尤其是侧基苄基修饰的L10-MMBen表现出对PG很好的选择性，其对具有不饱和脂肪尾链POPG的相互作用比POPS强14.2倍，对DOPG的相互作用比DOPS强9.3倍。L10-MMBen对具饱和脂肪尾链的DPPG表现出强相互作用，而对DPPS则没有明显作用。根据分子动力学模拟发现，L10-MMBen与POPS磷脂膜相互作用时，有较多的水分子阻隔在中间，减弱了它们之间的相互作用；而与POPG磷脂膜相互作用时则没有水分子的阻隔。

图1 RAPs选择性识别细菌磷脂PG

进一步研究L10-MMBen与POPG的相互作用模式，发现L10-MMBen可以诱导POPG重组装形成多层层状结构，其中聚肽与磷脂层呈平行间隔排列（图2）。将L10-MMBen逐滴滴到POPG溶液中，会诱导白色沉淀的产生，通过小角X射线衍射发现该沉淀具有层状结构，层间距比单纯POPG组装结构大1.36 nm。而将聚肽聚合度增加到30，L30-MMBen诱导POPG行成沉淀的层间距并没有显著增加。冷冻透射电子显微镜同样观察到L10-MMBen与POPG组装形成层状结构，层间距和小角X射线衍射结果相符。并且全原子模拟实验表明L10-MMBen的横截面约为1 nm，作者推测L10-MMBen诱导POPG囊泡重组装形成多层层状结构，其中聚肽与磷脂层呈平行间隔排列。巨型囊泡实验结果进一步表明Cy5标记的L10-MMBen可以诱导含PG的巨型囊泡融合和变形，但不会导致含PS的巨型囊泡融合。单分子荧光成像技术进一步也证明Cy5标记的L10-MMBen会诱导含PG的磷脂双分子层形成双层结构。

图2 L10-MMBen驱动PG重排形成层状结构

这种磷脂识别作用具有螺旋结构依赖性（图3）。相同化学组成的DL型无规结构聚肽DL10-MMBen与PG、PS磷脂均无特异性相互作用，而D型螺旋结构聚肽D10-MMBen则类似于L型聚肽。通过理论计算模拟，作者发现，相比于crossing-cylinder（CC）亚稳态，L10-MMBen与POPG作用形成层状结构的吉布斯自由能（∆G）低-4.11 kJ mol-1，热力学上有利于层状结构的形成；而DL10-MMBen与POPG作用形成层状结构的吉布斯自由能变化（∆G）比CC态高3.92 kJ mol-1，体系容易陷入亚稳态，热力学上不利于层状结构的形成。

图3 螺旋度对PG识别至关重要，并赋予L10-MMBen/PG组装的热力学和动力学优势

此外，疏水结构的隐藏对于抗菌聚肽对磷脂识别也很关键（图4）。在聚肽端基增加“暴露”的疏水烷基链会显著降低聚肽对PG和PS的选择性，而将聚肽侧基季胺和主链距离增加一个碳原子的距离，则可使磷脂的选择性增加到约29倍。

图4 疏水区域的隐藏对于PG识别具有关键作用

磷脂识别可以赋予螺旋结构聚肽高抗菌活性和抗菌选择性，与不能识别磷脂且具有相同化学组成的DL10-MMBen相比，L10-MMBen对大肠杆菌（ATCC 35218）和金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）的抗菌活性和抗菌选择性分别增强了1500倍和3750倍，而溶血活性无明显差异（图5）。在膀胱感染、盲肠穿刺诱导的败血模型中，L10-MMBen均表现出很好的治疗效果，并且以20倍治疗剂量静脉注射时不会引起明显组织毒性（图6）。

图5 PG识别特性赋予L10-MMBen高选择性抗菌

图6 L10-MMBen具有低系统毒性和良好的体内抗菌活性

该研究通过构效关系研究，阐明了抗菌肽磷脂识别的结构规律及机制，实现了细菌磷脂PG选择性识别抗菌肽的理性设计，为抗菌肽及抗菌药物的开发提供细菌特异性磷脂识别的新范式。

该研究受到国家重点研发项目、国家自然科学基金（区域联合重点项目、面上项目等）、以及广东省自然科学基金等项目资助！