生物发光与荧光成像：动物活体成像技术的选择指南

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@小白创作中心

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https://www.bio-equip.com/showarticle453138959.html

在生物医学研究中，动物活体成像技术是监测疾病进展和治疗效果的重要工具。然而，研究人员在使用GFP标记的肿瘤细胞进行体内成像时，常常会遇到信号弱、背景干扰大的问题。本文将从生物发光和荧光成像两种技术的原理出发，探讨它们在实际应用中的优缺点和适用场景，帮助研究人员选择最适合的成像方法。

当我们用动物活体成像系统来检测构建的小鼠肿瘤模型是否成功时，通常会遇到一个问题，那就是用GFP报告基因标记的肿瘤细胞在显微镜下虽然能检测到强发光信号，但是一旦注射进体内后，虽然也能检测到信号，但是背景扣除后就没有有效信号（图1），这是为什么呢？

图1：GFP标记肿瘤细胞成像及背景扣除后的效果

要回答这个问题，我们首先要明白活体成像的成像原理。小动物活体成像是通过一定的方式对研究对象进行光学标记，使其具有发光的性质，再通过成像技术及设备对光信号进行采集成像。光学标记方式主要采用生物发光与荧光两种技术。

生物发光现象在萤火虫（图2）、部分水母等物种中较为常见，这是一种自发光现象，无需外源激发光的照射，经研究发现，这种自发光现象是由于特定的酶促反应引起的，比如荧光素酶和底物荧光素之间的化学反应，导致荧光素被氧化而发光（图3）。

图2：萤火虫的生物发光现象
图3：荧光酶素和荧光素的酶促反应

根据这一原理，科学家先通过转基因技术把荧光素酶报告基因导入肿瘤细胞，接着把肿瘤细胞注射进动物体内，一段时间以后再注射荧光素，由于荧光素容易扩散进入肿瘤细胞，因此会被氧化发光，从而通过检测光信号就能实现对肿瘤细胞的跟踪。

在一定范围内，发光强度与被标记的细胞数量正相关，通过对发光信号的定量，可以反应肿瘤组织的变化情况。活体成像系统依靠高灵敏度的相机，可以捕捉这种微弱的生物发光信号。因为哺乳动物体内不会有荧光素酶报告基因的存在，因此这种检测方法的优势是特异性好，无背景信号干扰。缺陷是应用范围较窄，只能够用于标记细胞。

当荧光物质被特定波长的激发光照射后会吸收能量转变为激发态，激发态并不稳定，会发出另一种波长的光来释放能量，而活体成像系统就是通过捕捉另一种波长的光信号来检测荧光物质的存在（图4），并且光信号的强度在一定的范围内与荧光物质的量成线性关系。

图4：荧光物质受激发后发光的原理

因此荧光信号的采集需要额外的激发光源，并且在相机镜头前还要加装一块发射光滤光片。每个荧光通道的组成都包括激发光源+发射光滤光片。

荧光成像的优点是应用范围广，不仅可以标记细胞，还可以标记药物、纳米载体等。缺点主要有以下2个方面：

某些荧光物质的发射波长较短，容易被吸收，导致穿透性差，体内成像效果差。比如GFP绿色荧光蛋白的发射光中心波长在510nm左右，容易被血红蛋白或其他生物组织吸收，导致成像效果差。
许多动物组织（例如毛发、肠道、血管等）受激发光照射后，也会发出500-600nm左右的发射光，这就跟GFP、FITC这类荧光物质的发射光接近，造成成像的背景信号较高，信噪比低，不容易区分有效信号和背景信号。常见生物组织的发射光波长信息请见图5。

图5：常见生物组织的发射光波长

通常的解决办法是选择发射波长较高的荧光物质（发射波长>700nm）进行体内成像，例如DiR、ICG、CY7等。不同发射波长的信号采集效果差异请见图6。

图6：不同发射波长信号采集的差异