西华大学研究团队：酒曲中产酶微生物的筛选及其对发酵米酒品质的影响
西华大学研究团队：酒曲中产酶微生物的筛选及其对发酵米酒品质的影响
米酒是一种以糯米、大米、黑米等为主要原料，经酒曲中的微生物酿造而成的传统发酵型酒精饮料。酒曲是米酒酿造必不可少的糖化剂、发酵剂和生香剂，含有丰富的微生物及其代谢产生的复杂酶系，故有“曲乃酒之骨”之称。米酒中的营养物质及风味成分的形成离不开这些功能酶的催化作用。近年来许多研究学者开始尝试将传统酒曲中的功能微生物与商业酒曲复配发酵米酒，使两者优势互补，以改善和提高米酒的风味品质。
西华大学食品与生物工程学院的邹玉婷、贺紫涵、陈兰钗等从不同地区的传统酒曲中筛选出能够同时产淀粉酶、酯化酶、酸性蛋白酶的可培养真菌，将具有高活性的微生物制备成单菌曲，与商业甜酒曲进行复配发酵米酒。以商业甜酒曲发酵的米酒为对照，测定米酒的基本理化指标、有机酸、氨基酸、挥发性物质等，探究产酶微生物对发酵米酒品质的影响，以期为商业酒曲提供候选微生物资源。
菌株初筛
根据鉴别培养基筛选，共有29 株菌在培养基中产生透明圈。其中5 株在3 种鉴别培养基上均产生透明圈，分别命名为M1、M8、M10、XG、HB，蛋白酶透明圈比值最大的为菌株HB，淀粉酶和酯化酶透明圈比值最大的都为菌株XG（表1）。
菌株酶活力
对5 株菌进行酶活力测定，淀粉酶活力在4.42～5.51 U/mL之间，其中菌株M1的淀粉酶活力最高（5.51 U/mL），但与菌株H B 的淀粉酶活力（5.17 U/mL）无显著差异（P＞0.05）（图1A）。酸性蛋白酶活力间存在显著性差异（P＜0.05），酶活力在0.58～1.93 U/mL范围内（图1B），活力最高的为菌株HB（1.93 U/mL），与初筛结果一致。酯化酶活力也存在显著性差异，酶活力在20.87～293.52 U/mL之间，其中菌株M10酶活力最高（293.52 U/mL）（图1C）。
菌株鉴定结果
对筛选得到的5 株产酶真菌进行18S rDNA鉴定，表明菌株M1为米根霉（R. oryzae）、菌株M8为卷枝毛霉（M. circinelloides）、菌株M10为兰瑟毛霉（M. lanceolatus）（图2A）、菌株XG和HB为扣囊复膜酵母（S. fibuligera）（图2B）。
复配曲对米酒中理化指标的影响
所有发酵的米酒还原糖质量浓度大于100 g/L（图3A），因此所有酿造的米酒为甜型米酒（GB/T 13662—2018）。相较于对照组而言，所有复配组的还原糖质量浓度更低，乙醇体积分数更高（图3B），可能是产酶微生物能够水解更多的原料生成供酵母利用的糖，进而发酵产生更多的乙醇。总酸质量浓度介于4.06～5.97 g/L之间，不同复配曲发酵的米酒总酸质量浓度有显著差异（P＜0.05）（图3C），但均在GB/T 13662—2018规定范围内。氨基酸态氮质量浓度在0.18～0.26 g/L之间，其中SF2组质量浓度最高，为0.26 g/L（图3D），可与一级稻米黄酒（0.25 g/L）相媲美。
复配曲对米酒中有机酸的影响
有机酸是米酒中的主要酸类物质，具有一定抑制致病菌的作用，适量的有机酸能为米酒带来特定的香气和口感。从表2可以看出，乳酸、琥珀酸是米酒中的主要有机酸，其中乳酸可赋予酒涩感、尖利酸味的风味，琥珀酸赋予酒酸、咸、苦的复合味。对照组乳酸质量浓度显著高于所有复配组（P＜0.05），高达4.80 g/L，可见添加了产酶真菌可降低乳酸质量浓度，从而减少乳酸对酒带来的涩感和尖利酸味。琥珀酸对酒的风味具有重要影响，SF1和SF2组米酒的琥珀酸质量浓度显著高于其他组别（P＜0.05）。柠檬酸赋予酒清爽的酸味，SF2组米酒中柠檬酸的质量浓度最高，为1.12 g/L，但与SF1组无显著性差异（P＞0.05）。酒石酸和草酸也是米酒的重要呈味物质，SF2组的酒石酸和ML组的草酸质量浓度显著高于其他组（P＜0.05）。富马酸是一种不饱和酸，具有小曲的香气，各组米酒中富马酸含量低且无显著差异（P＞0.05）。正是这些有机酸的相互协调，赋予了米酒独特的风味。SF1和SF2组增加了有机酸的种类和质量浓度，尤其是SF2组总有机酸质量浓度最高，可能添加S. fibuligera有助于改善米酒的口感和协调性。
复配曲对米酒中氨基酸的影响
米酒常被称为“液体蛋糕”，因为与其他酒类相比其含有丰富的氨基酸。氨基酸是米酒中重要的营养和前体物质，主要来源于蛋白质水解和酵母自溶，在发酵过程中为微生物的生长提供氮源。氨基酸在发酵后会产生各种味道，因此将测定的氨基酸分为甜味、鲜味、苦味和涩味氨基酸。
由表3可知，6 组米酒一共检测出17 种氨基酸。6 组米酒中苦味氨基酸质量浓度在2.72～4.38 g/L，其中SF2和RO组的苦味氨基酸质量浓度较低，与其他组之间具有显著差异（P＜0.05），且Arg在SF2组发酵的米酒中并未检测到。6 组米酒中甜味、鲜味氨基酸质量浓度分别为1.88～3.00、2.14～3.36 g/L，最高的均为SF1组，与对照组相比提高了59.57%、54.13%。除RO组，复配组氨基酸总质量浓度相较于对照组（7.14 g/L）都有明显提高，尤其是SF2组，苦味氨基酸质量浓度最低，但总氨基酸质量浓度（8.44 g/L）相较于对照组仍提高了18.21%。总体而言，各组米酒的呈味氨基酸主要为苦味、鲜味、甜味，涩味氨基酸占比最低（图4）。除SF2组外，其余组别苦味氨基酸占比最高（38.91%～39.59%），而SF2组中占比最高的为鲜味氨基酸（33.16%）。在6 组米酒中，SF2组的甜味氨基酸和鲜味氨基酸占比最高（29.86%、33.18%），而苦味氨基酸占比最低（32.22%）。因此，添加S. fibuligera HB对提高米酒中甜味、鲜味氨基酸，降低苦味氨基酸占比有明显作用。
复配曲对米酒中挥发性物质的影响
挥发性化合物是米酒香气的主要来源，是影响酒类产品质量的主要因素之一。6 组米酒中一共检测出165 种物质，其中酯类55 种、醇类47 种、酸类18 种、醛类18 种、酚类9 种、酮类10 种、其他类8 种（图5）。对照组一共检测出71 种物质，而所有复配组酿造的米酒中挥发性物质种类均较对照组增加，RO、MC、ML、SF1和SF2组挥发性物质种类分别为78、93、76、109 种和77 种。对照、RO、MC、ML、SF1和SF2组的挥发性物质总质量浓度分别为25.55、30.31、7.78、8.76、14.98 mg/L和60.67 mg/L，其中RO和SF2组挥发性物质总质量浓度较对照组分别提升了18.63%、137.46%，由此可见不同的复配曲对挥发性物质质量浓度也有显著影响。
酯类化合物是米酒风味中的主要贡献者，由发酵过程中酸和醇的酯化作用形成，具有良好的芳香气味。其中，添加S. fibuligera HB发酵的米酒酯类物质的质量浓度最高，为32.93 mg/L，相比对照组（13.74 mg/L）提高了139.66%。6 组米酒中的酯类物质主要是棕榈酸乙酯、反油酸乙酯和十四酸乙酯，而复配曲发酵都增加了亚油酸乙酯的质量浓度（图5A）。亚油酸乙酯是一种高级脂肪酸酯，可降低胆固醇和血脂含量。SF2组还显著增加了乙酸乙酯的质量浓度（1.62 mg/L），而对照组并未检测到。乙酸乙酯是清香型米酒中的主体香气成分之一，主要呈现为花果香气。
醇类化合物是米酒中的主要呈香物质，由糖发酵、氨基酸分解代谢等产生。SF2组米酒中的醇类物质质量浓度在各组中最高，为21.77 mg/L，显著高于对照组（6.64 mg/L）。异戊醇、苯乙醇和异丁醇是各组米酒中的主要醇类物质（图5B），这与孙海龙的研究一致。SF2组中这3 种醇质量浓度均最高，分别为8.32、6.22、3.53 mg/L。异丁醇、异戊醇及苯乙醇是苹果白兰地中主要的高级醇，能增加酒的协调和饱满感，而苯乙醇更是一种具有独特玫瑰香味的化合物，对米酒风味具有重要贡献。可见添加S. fibuligera HB可以增加米酒中醇类物质质量浓度，尤其是对风味具有重要贡献的醇类物质。
酸类物质是米酒中重要的风味物质之一，也是酒的风味前体物质。 MC、ML、SF1组的酸类物质质量浓度显著低于对照组，而RO和SF2组显著高于对照组（图5C）。 对照组中十六酸在酸类中的相对含量高达77.17%，而排第二的乙酸仅占0.10%。 RO组中十六酸（47.98%）、丁酸（17.00%）和肉豆蔻酸（15.90%）共占总酸的80.88%，酸分布较对照组更均匀。 SF2组的主要酸为十六酸（36.90%）、异丁酸（23.73%）和草酸（20.77%），共占总酸的81.4%，显然SF2组酸分布最均匀，因此添加 S. fibuligera HB明显促进了酸类物质的协调性，在一定程度上可以改善米酒由于单一物质过高造成的风味不协调，从而使米酒口感更醇厚。 微量的乙酸、辛酸、奎酸能提高米酒的口感和香气，但是过量则会产生脂肪、腐臭等异味，改变米酒的味道，降低其质量。 复配曲发酵的米酒能有效减少这3 种酸的生成。
此外，酚类、醛类、酮类等物质，虽然它们只占一小部分，但都是影响米酒风味的主要因素，如4-乙基苯酚呈果香，苯乙醛有水果的香甜气，3-羟基-2-丁酮呈奶油香气。总体来说，米酒的风味是各类物质协同贡献的结果。
为进一步分析各组米酒中的重要差异挥发性物质及这些物质对米酒风味品质的贡献，对6 组米酒中的挥发性物质进行正交偏最小二乘判别分析（OPLSD A）。 模型拟合结果为自变量拟合指数（ )为0.866、 因变量拟合指数（)为0.964、模型预测指数
Q
2为0.932，
R
2和
Q
2均大于0.5，表明模型拟合可靠。6 组米酒具有明显的分离性（图6A），说明各组米酒挥发性物质组成差异较大。各组中鉴定出56 种重要挥发性物质（变量重要性投影（VIP）＞1），其中酯类19 种、醇类15 种、酸类8 种、醛类2 种、酚类6 种、酮类5 种、其他类1 种（图6B）。56 种重要化合物的总质量浓度在各组的占比均高于80%，分别为对照组88.52%、RO组82.55%、MC组83.52%、ML组85.05%、SF1组84.19%、SF2组82.07%，可见这56 种化合物对米酒风味具有重要贡献作用。SF2组的米酒在右下侧，在它周围有大部分的重要物质如棕榈酸乙酯、苯乙醇、乙酸苯乙酯等，MC、ML、SF1组的米酒聚集在左侧，因为这3 组酒中挥发性物质含量较低，所以周围无重要物质。从图7可以看出，各组米酒中的主要挥发性物质以棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯、反油酸乙酯、异戊醇、苯乙醇、十六酸等为主，而56 种重要差异物质中，有30 种物质在SF2组含量最高，如棕榈酸乙酯、异戊醇、苯乙醇等，可见，添加S. fibuligera HB进行米酒发酵可以显著提高米酒中重要挥发性化合物的含量。综上，不同的复配曲对米酒中重要挥发性成分的占比也有很大的影响。
结 论
本研究从不同地区的酒曲中筛选出5 株产蛋白酶、淀粉酶、酯化酶的可培养真菌，经鉴定分别为R.oryzae、M.circinelloides、M.lanceolatus和两株S. fibuligera。将产酶真菌与商业酒曲进行复配发酵米酒，对米酒中的理化指标、有机酸、氨基酸和挥发性成分进行分析，结果表明6 组米酒的理化指标均在国家标准范围内。两组添加S. fibuligera发酵的米酒有机酸含量均显著高于对照组；且S. fibuligera HB组提高了甜味、鲜味氨基酸占比，降低了苦味氨基酸的含量。所有复配组挥发性物质种类多于对照组，且接种R.oryzae和S. fibuligera HB组相较于对照组，挥发性物质含量显著提高，尤其是S. fibuligera HB与对照组相比提高了137.46%。综上，所有产酶微生物对米酒发酵均有不同程度的影响，其中S. fibuligera HB具有突出的产香能力，能有效改善商业米酒酒味寡淡、风味不足的现象，具有在米酒发酵中的应用潜力。
本文《酒曲中产酶微生物的筛选及其对发酵米酒品质的影响》来源于《食品科学》2024年45卷10期108-117页。作者：邹玉婷，贺紫涵，许碧涛，陈兰钗，张 庆。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230922-208。