蛋白质组学样品制备全流程详解
蛋白质组学样品制备全流程详解
蛋白质组学是生命科学研究的重要领域，通过对蛋白质的鉴定和定量分析，可以揭示生物体内复杂的分子机制。在蛋白质组学研究中，样品制备是至关重要的第一步，它直接影响后续质谱检测的结果。本文将为您详细介绍蛋白质组学样品制备的关键流程和技术要点。
前言
本系列的第三讲中，我们盘点了TMT、LFQ等蛋白质组研究中样本制备层面的常用技术。在本讲中，我们将简要介绍应用这些技术的蛋白质组学样品制备流程。
目前基于质谱的蛋白质组学分析中应用最广泛的策略是自下而上法(bottom-up)，也称为“鸟枪法”（shotgun）。该方法的大致过程是将从样本中提取到的蛋白水解/酶解为肽段，然后进行质谱检测，根据肽段的鉴定和定量信息推测出其对应蛋白的鉴定和定量结果。因此，目前的蛋白质组学样品制备流程，通常均会包括蛋白提取、蛋白酶解和肽段除盐三个步骤。根据样本类型、研究目的和技术方法的不同，样品制备过程中可能还会加入蛋白定量、修饰肽段富集、稳定同位素标记、分级分离等步骤。
1 蛋白提取
生物样本中除了蛋白质，通常还会含有大量的其它成分，如脂质、核酸、无机盐和各种小分子代谢物等，其中许多成分可能影响后续的蛋白酶解和质谱检测。蛋白提取正是为了将样本中的蛋白质充分释放到溶液中以便于后续反应，并对蛋白质进行初步分离纯化。
在蛋白提取过程中，通常会在生物样品加入裂解液，利用其中的SDS、SDC、NP40、TritonX100、Urea等去垢剂成分破坏生物样本的固有结构，将蛋白变性以促进其释放和溶解。有时还会结合超声、研磨等物理方法促进蛋白质的释放。
如果样品中杂质过多，或在蛋白提取过程中引入了SDS等成分（可能影响后续反应和质谱检测），后面往往会通过蛋白沉淀和复溶等方法对样品进行进一步纯化。
不同类型的样品，往往也会有各自特有的提取步骤。如：SDS-PAGE后染色的胶条，通常需要进行脱色或脱银处理，并清洗掉胶条中游离的SDS；FFPE组织样品，需要通过二甲苯进行脱蜡处理；血浆或血清样本，可能会选择通过一些试剂盒去除血液高丰度蛋白以在一定程度上提高蛋白鉴定率。
2 蛋白酶解
蛋白质是一类含有空间结构的高分子化合物。在酶解前，通常需要先加入二硫苏糖醇（DTT）或三（2-甲酰乙基）磷盐酸盐（TCEP）等还原剂，打开二硫键，并以碘乙酰胺（IAA）或氯乙酰胺（CAA）等烷基化试剂封闭游离的巯基，从而进一步破坏蛋白二级结构，提高酶解效率。
（蛋白酶解示意图)
参考文献：Batalha, I. L.; Lowe, C. R.; Roque, A. C. A., Platforms for enrichment of phosphorylated proteins and peptides in proteomics. Trends in Biotechnology 2012, 30 (2), 100-110）
蛋白质组学中常用胰蛋白酶（Trypsin）进行酶解处理，胰蛋白酶能特异性识别并剪切赖氨酸和精氨酸C端肽键，将蛋白酶解为适宜质谱检测的肽段长度，并通过赖氨酸和精氨酸侧链使得肽段带有正电荷，以利于质谱检测中肽段的离子化。
对于某些赖氨酸和精氨酸分布过多或过少的蛋白，或希望鉴定到的肽段尽量多的覆盖全蛋白序列，也可以考虑换用其他蛋白酶或多种蛋白酶分别或顺序酶切，以产生合适的肽段，达到检测目的。
3 肽段除盐
蛋白样本前处理通常是在含盐缓冲体系中进行，但是并不是所有的盐都能进入质谱检测。一方面，不可挥发的盐会因为结晶留在喷雾针附近，容易造成喷雾针的堵塞，损耗质谱的寿命；一方面，盐离子进入质谱后，可能抑制目标物质的离子化，妨碍目标分子的质谱检测。所以我们需要进行肽段除盐，目前常使用层析法，主要原理是SDB或C18材质的层析柱可以结合待检测肽段，而盐类物质和其他一些杂质在通过层析柱的时候会流穿过去，从而达到分离和纯化肽段的目的。
脱盐后的肽段通过真空离心浓缩仪抽干后，即可于4℃或-20℃短期保存，等待后续的质谱检测。
4 蛋白定量
在蛋白提取后，蛋白酶解之前，通常会以BCA或Bradford等方法对蛋白溶液的浓度进行测定，测定的目的有两个：一方面，通过蛋白定量确定待酶解蛋白的含量，便于后续将蛋白溶液调整至适合酶解反应的蛋白浓度，并按比例加入胰蛋白酶，以免酶解不充分或过度酶解。另一方面，通过蛋白定量也可以将同批次的不同样品调整到一致的质谱检测上样量，从而避免因样品量差异过大而导致的批次效应。
但某些样品，如SDS-PAGE后的胶条、IP富集纯化后的蛋白等，蛋白总量过少，难以进行定量检测，或定量检测会造成大量的样品损失，定量的步骤就会省略掉。只能根据经验加入胰酶，并尽量保证样品来源的起始用量一致。
5 稳定同位素标记
基于稳定同位素标记的TMT或iTRAQ定量方法，是通过标记试剂与氨基酸末端氨基（N端）以及赖氨酸（Lysine）侧链游离氨基结合，实现对多肽的标记。其基本步骤是，将同批次待比较的肽段样品分别与不同通道的标记试剂混合反应，然后将不同标记的样品等量混合，用于后续质谱检测。
为了提高标记定量的准确性，标记定量的项目通常都需要对酶解前的各个样品进行准确的蛋白定量测定。
一般来说，同批次样品的质谱检测定量数据重复性更好，目前TMT标记试剂同批次已可以最多标记18个不同的样品，满足更多类型的实验设计。
6 分级分离
这里分级分离是指以液质联用系统以外的液相色谱将待检测样品分为多个不同的组分，分别进行质谱检测。将复杂的混合样本通过高效液相色谱（HPLC）的预分离转化为多个相对简单的样本再分别进行LC-MS检测，可以降低单次检测的样品复杂度，从而达到增加样本分析深度的目的。理论上更多的馏分（fraction）可以获得更高的样品分析深度，检测和定量到更多的肽段和蛋白。不过这种增长并不是呈线性关系的，分级的级数达到一定程度时，能鉴定到的蛋白数量的增长就会饱和。因此根据样本复杂程度，通常会将样品分级成10-30个馏分进行检测。
（不同fraction蛋白的鉴定数量)
参考文献：Chen Ding，A Fast workflow for identification and quantification of proteomes,MCP,2013,12:2370-2380
由于TMT/iTRAQ标记定量中将不同标记的样品混合，通常应用于较复杂的样品，为了获得较理想的检测分析结果，TMT/iTRAQ标记的样品通常均会进行分级分离。
7 修饰肽段富集
蛋白质修饰组学是蛋白质组学的重要部分。生物样本中天然存在的翻译后修饰比例通常较低，在质谱检测时可能被未修饰肽段的检测信号覆盖而难以检测。为了提高蛋白翻译后修饰的鉴定深度，通常在修饰组学研究的样品制备步骤中，会通过富集将修饰肽段分离纯化之后再进行质谱检测分析。
根据修饰本身的性质，不同的翻译后修饰会以不同的方法进行修饰肽段富集，因此在修饰组学研究中，通常一次只能分析同一种翻译后修饰。以目前研究最多的磷酸化修饰为例，目前常用的磷酸化修饰肽段富集方法主要有三种，分别为基于抗体的磷酸化肽段富集、基于二氧化钛（TiO2）的磷酸化肽段富集和基于固相金属离子亲和层析(IMAC)的磷酸化肽段富集。
（磷酸化肽段的富集)
参考文献：Batalha, I. L.; Lowe, C. R.; Roque, A. C. A., Platforms for enrichment of phosphorylated proteins and peptides in proteomics. Trends in Biotechnology 2012, 30 (2), 100-110）
总结
样品制备是蛋白质组学检测分析的重要步骤，与质谱检测结果的质量息息相关。多年来，许多蛋白质组学研究的课题组开发和公布了大量不同的蛋白质组学样品制备方法。这些方法的基本原则大致相同，其主要流程均是将蛋白样品酶解为适宜质谱检测的肽段，并在此过程中尽量降低蛋白损失、去除其他杂质干扰。但根据各类样品自身性质、研究目的、检测分析方法的不同，不同的蛋白质组学项目往往会采用不同的样品制备流程和实验操作步骤，以获得较理想的质谱检测效果和数据分析质量。