细胞培养基的开发历程与优化策略
细胞培养基的开发历程与优化策略
细胞培养基是生物技术领域中至关重要的组成部分，其发展经历了从早期血清培养基到现代化学限定培养基的演变。本文将详细介绍细胞培养基的开发历程、关键成分以及优化策略，帮助读者深入了解这一领域的最新进展。
一、培养基的开发历史
早期用于培养动物细胞的培养基，多由血浆、血清或组织提取物组成。Harry Eagle 实验室成功开发出一种培养基，可同时支持小鼠成纤维细胞和 HeLa 细胞（人类子宫癌细胞）的生长。血清作为复杂的生物流体，富含营养素、激素、生长因子等，对细胞生长至关重要。F12 培养基是早期完全合成、化学提炼且无血清的成功案例，可支持中国仓鼠卵巢（CHO）细胞的克隆生长。此后，无血清培养基不断发展，旨在提升细胞密度、活力及重组蛋白滴度。
二、培养基的关键成分
（一）水
哺乳动物细胞对水中杂质极为敏感，杂质包括微量元素、细菌、内毒素、微量有机物和颗粒。水净化系统涵盖蒸馏/去离子、微滤和反渗透。水的纯度通常以电导率或电阻（>18 MΩ·cm）和低有机碳含量（≤15 ppb）衡量，且需无内毒素。注射用水（WFI）因易于获取、纯度高且无内毒素和支原体，常被选用。
（二）能量来源（碳水化合物、谷氨酰胺、谷氨酸）
碳水化合物：葡萄糖是主要的能量和碳源。CHO 细胞通过糖酵解将葡萄糖转化为丙酮酸盐，再经 Krebs 循环产生 ATP。在无血清培养基中，CHO 细胞可在低葡萄糖浓度（<3 mM）下保持高活率。为降低代谢产物影响，半乳糖和果糖可作为替代碳源。
谷氨酰胺：谷氨酰胺是 CHO 细胞培养中的主要能量来源，通过谷氨酰胺分解代谢进入 TCA 循环。其缺乏会推迟细胞指数生长阶段。谷氨酰胺代谢产生游离铵，高铵浓度会抑制细胞生长。基于谷氨酰胺的二肽（如丙氨酰谷氨酰胺）可降低代谢速率并控制铵释放。谷氨酸作为替代能源，可降低铵和乳酸生产速率，提升细胞生长和滴度。
（三）氨基酸
氨基酸是 CHO 细胞培养基的关键成分，尤其在化学成分降解的培养基中。氨基酸组成微小变化可影响细胞生长、滴度和产物糖基化修饰。某些氨基酸可减轻铵和 pCO₂积累的不良影响，甚至充当信号分子降低凋亡率。氨基酸分为非必需氨基酸（NEAA）和必需氨基酸（EAA），优化 NEAA 和 EAA 的相对浓度可提升重组单克隆抗体生产率。
缺乏亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或苯丙氨酸可增加运输系统 L 的活性，提升相关氨基酸摄取率。色氨酸是限制因素之一，补充色氨酸可提高滴度和峰值细胞密度，但需防止其氧化。苏氨酸可保护细胞免受高铵等环境伤害，间接影响重组产物唾液酸化。赖氨酸和组氨酸可减少酸性异构体，但高浓度赖氨酸可能增加 C 末端赖氨酸变体。
丙氨酸在细胞培养中消耗缓慢，其产生率与氨基酸浓度正相关。精氨酸在抗体生产中被快速消耗，缺乏会导致细胞停滞，高浓度则抑制生长。天冬氨酸和天冬酰胺在谷氨酰胺和谷氨酸代谢中充当铵供体和受体。半胱氨酸是唯一含巯基的氨基酸，限制其供应对 CHO 细胞生长可能是致命的。丝氨酸是消耗量第二高的氨基酸，也是单碳（1C）单位代谢的主要供体。酪氨酸是影响 mAb 生产的关键氨基酸，低浓度会干扰蛋白质翻译。
一些氨基酸溶解度和稳定性较低，补料培养基常设计在较高 pH 下以提高溶解度，培养基需在黑暗中储存以保持稳定性。
（四）脂质
脂质是生物膜的主要成分，也可作为能量来源和信号分子。它们是内质网和高尔基体的关键组成部分，参与蛋白质合成、折叠、修饰和分泌。CHO 细胞通常能自行合成脂质，但重组 CHO 细胞可在无脂质培养基中适应和生长。磷脂可刺激 CHO 细胞生长，脂肪酸和胆固醇需加入替代物以增加溶解性和稳定性，脂肪酸浓度应保持较低水平以避免脂毒性。
（五）维生素
维生素在信号级联、酶抑制和激活中起辅酶、辅基或辅因子作用，其高还原能力可保护细胞免受氧化自由基伤害。维生素是细胞培养基的重要成分，尤其在化学限定的培养基中。在 CHO 细胞培养中，添加维生素可显著提高 mAb 产量。
许多维生素易受高温、强光和空气氧化影响。抗坏血酸和生育酚对空气氧化敏感；硫胺素、核糖核酸、钴胺素和抗坏血酸对光敏感；硫胺素和泛酸对热敏感。因此，培养基储存需保护免受光和热影响。
（六）微量元素
细胞培养基中微量元素的有效浓度通常很低，但它们在代谢途径调节、酶和信号分子活性中发挥关键作用。在 CHO 细胞培养中，铜缺乏会导致乳酸脱氢酶和其他线粒体氧化酶下调，引发组织毒性缺氧。铁在氧转移中起关键作用，无血清培养基中可添加重组转铁蛋白以提高铁的稳定性和摄取率。锌是影响 mAb 产量的重要微量元素之一，补充锌可显著提高产量。
（七）无机盐
盐类在 CHO 细胞培养基中起着重要的化学和生物学作用，包括维持细胞膜电位、渗透压和缓冲作用。通常添加的盐离子包括钠、钾、镁、钙、氯化物、磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐和硝酸盐等。钙和镁的缺乏会触发 CHO 细胞凋亡。
（八）生长因子
生长因子通常是肽、小蛋白和激素，作为信号分子影响细胞生长、增殖、恢复和分化。胰岛素及其类似物是无血清培养基中使用最广泛的生长因子之一。金羧酸（ATA）可作为替代方案，通过作用于 IGF-1 受体促进 CHO 细胞生长。
（九）多胺
多胺在多种代谢过程中发挥关键作用，包括 DNA 合成和转录、核糖体功能、离子通道调节和细胞信号传导。多胺分解代谢会产生抑制细胞生长的物质，因此培养基中多胺的补充应控制在细胞毒性限度以下。
（十）非营养成分
CHO 细胞培养基中的一些非营养成分可为细胞提供更稳定的物理或化学环境。这些成分包括缓冲剂、表面活性剂和消泡剂，对细胞生长和生产力有显著影响。
缓冲剂是细胞培养基的重要组成部分，传统培养基如 DMEM 和 1640 常应用碳酸氢盐缓冲系统（CO₂/NaHCO₃）。Pluronic F-68 是一种表面活性剂，可保护细胞免受气泡破裂引起的机械应力影响。消泡剂是强疏水性表面活性剂，用于控制和减少泡沫。
三、培养基的优化
（一）工业应用优化培养基的设计元素
工业细胞培养过程需要适应一致大规模生产和制备的培养基。干粉和液体培养基配方应针对影响可制造性的属性进行优化，如组分溶解度、培养基过滤、灭菌、储存稳定性、培养基制备可放大性和原料一致性，且批次间变化最小。
大多数现代细胞培养生产工艺都使用化学限定、无血清和无动物成分的培养基。这解决了血清或动物成分引起的潜在污染问题，以及未确定的培养基成分（如水解产物）的一致性和再现性问题。某些培养基成分在稳定性和溶解性方面具有不稳定性，液体培养基通常保持低温，并在储存期间避光，以防止光敏或热不稳定引起的降解。
（二）培养基优化的实验方法
确定了所需细胞培养基的关键设计元素后，可采取几种不同的、潜在互补的培养基优化方法。从本质上讲，培养基中每种成分的特定浓度应根据细胞系的利用率及其对滴度、生长和产品质量的影响进行优化。
前面描述的许多基本培养基成分，包括葡萄糖、氨基酸、维生素、脂质和脂肪酸，在细胞生长过程中以化学计量的方式消耗。因此，可通过分析废细胞培养基和计算每种成分的特定利用率，对这些营养素进行化学计量优化。
四、结论
细胞培养基的发展历程体现了从早期含血清的简单配方，到包含复杂水解产物的培养基，再到如今完全化学限定且在某些情况下无蛋白的先进配方的逐步演进。在此过程中，通过重新平衡基础培养基与补料培养基的组成，优化营养输送的同时精准控制最终渗透压，结合化学计量补料策略，细胞培养过程与培养基设计实现了协同发展，极大地提升了细胞培养的性能与一致性。现代“组学”方法的应用，为培养基的进一步开发与优化提供了更深入的机制见解，助力实现生物制造领域中高效且稳定的细胞培养目标。
本文原文来自univ-bio.com